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PeaT1是一种从极细链格孢菌中分离纯化的激活蛋白,具有促进植物生长、提高植物抗性的作用。为了阐明PeaT1多效机制是否取决于分子内部可能存在的功能域,本文分析了PeaT1的结构域,构建了PeaT1及其三个缺失突变体表达载体,分别诱导表达目的蛋白,以期分析PeaT1结构域对其生物学效应和蛋白特性的影响。主要研究结果如下:1.peaT1及其缺失突变体表达载体的构建通过提取极细链格孢菌的总RNA,反转录成cDNA,进而扩增获得了peaT1基因。利用生物信息学对PeaT1蛋白进行了初步分析,得知其有两个结构域:NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法扩增了3个缺失基因片段:peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108,将这三个片段分别与pET-28a连接构建了三个缺失突变体的融合表达载体。2.PeaT1及其三个缺失突变体蛋白的表达和纯化将peaT1和三个缺失基因片段的表达载体转入E.coli BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导进行表达,获得了PeaT1及其缺失突变体蛋白。用蛋白纯化系统(AKTA Explorer10.0)对表达蛋白进行His?Tag亲和层析和脱盐处理,通过生物质谱技术获得了PeaT1的标准分子量为26.319kD,与理论蛋白的分子量26.259kD相符。3.PeaT1及其突变体蛋白的功能比较与分析三个缺失突变体与PeaT1蛋白一样,对小麦生长和抗病性都有显著的促进作用,而各表达蛋白之间的生物活性没有显著差异。结合生物信息学分析和前人研究结果推测:PeaT1蛋白NAC保守区域的作用机理,可能是其充当分子伴侣的作用,促进蛋白的正确折叠,以及其通过OB结合域的方式与TBP等转录因子结合,通过转录共激发子的作用促进下游某些基因的转录来促进植物生长,提高抗性;UBA/TS-N保守区域,与翻译延伸因子EF1B(EF-Ts)相似,可能更多的是担当一种翻译共激发子来诱导植株生长和增强植物抗逆。由此推测,PeaT1的2个结构域可能具有独立或类似的生物功能。4.稳定同位素标记技术研究PeaT1及其突变体蛋白诱导日本晴蛋白的差异表达分别用15N和14N培养基培养日本晴幼苗,在相同的生长环境下,用PeaT1及其突变体蛋白处理15N标记的水稻(14N标记水稻作为对照)。通过质谱测定获得了近百种上调表达的蛋白,确定了PeaT1和3个缺失基因片段编码的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差异表达。通过对33种差异蛋白的功能分析,得知它们与植物叶绿体光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和翻译起始因子相关,为激活蛋白作用机理的研究提供了理论基础。5.PeaT1及其三个突变体蛋白的热稳定性分析对表达的PeaT1和三个突变体蛋白的耐热性进行了分析,结果显示它们都具有很好的热稳定性。通过氨基酸组成特性、三级结构的作用力分析了蛋白的耐热机制。分析显示,PeaT1及其突变体蛋白的氨基酸组成具有如下共同特征:含有较多的带电氨基酸形成盐桥;含有较多疏水氨基酸形成强大的疏水作用力;含有较多的Ala、Glu使蛋白更容易形成α-螺旋。含有极少的Gln、Asn、Trp和Cys等,避免它们分别因为脱氨、氧化和二硫键断裂等而致使蛋白不稳定。通过热稳定性分析结果,结合PeaT1蛋白的二级结构预测,推测NAC和UBA/TS-N两个结构域在空间是以相对独立而非聚集的形式存在。