酿酒酵母蛋白酶A是一种定位于酵母细胞液泡内的天冬氨酸蛋白酶,参与液泡内多种蛋白酶的成熟激活过程。胁迫条件下,酵母细胞中的蛋白酶A能够被分泌到细胞外。本课题对液泡分选途径中的关键蛋白Vps21p、组成型分泌途径中的关键蛋白Ypt32p、Sec4p及胞吐复合体的核心亚基Sec5p在蛋白酶A分泌途径中的作用进行了深入研究,初步证实了蛋白酶A的外泌通过组成型分泌途径来实现。本课题以酿酒酵母W303-1A为出发菌株,以KanMX基因作为抗性标记,利用两次同源重组的方式分别构建得到VPS21、SEC5和YPT32基因缺失突变株WV21、WS5和WY2;以酿酒酵母RY1的单倍体RY-A为出发菌株构建SEC4基因缺失突变株RS4。利用上述各突变株进行啤酒发酵实验,以研究各基因缺失对蛋白酶A分泌的影响,研究发现:(1)酿酒酵母中VPS21基因敲除后,与出发菌株相比,蛋白酶A的胞内活力降低15.2%,胞外活力提高为出发菌株的3.04倍,说明Vps21p介导着蛋白酶A向液泡内的运输过程,在蛋白酶A的液泡分选途径中发挥一定的促进作用;(2)酿酒酵母中Ypt32p功能缺失使得蛋白酶A胞内和胞外的酶活分别提高了17.5%和55.3%,初步证明了 Ypt31/32参与胁迫条件下酿酒酵母细胞内蛋白酶A的外分泌过程;酿酒酵母中胞吐复合体核心亚基Sec5p功能的缺失使得蛋白酶A的胞内活力提高36.7%,胞外活力降低29.4%,说明胞吐复合体在胁迫条件下蛋白酶A的外分泌过程中发挥促进作用;酿酒酵母中SEC4基因敲除后,蛋白酶A胞外酶活提高49.7%,而胞内酶活没有明显变化,说明Sec4p能够在胁迫条件下蛋白酶A的胞外分泌途径中发挥一定阻碍作用。(3)由于在囊泡运输过程中,Ypt31/32介导着囊泡在反面高尔基体上的出芽过程,胞吐复合体介导着囊泡在质膜上的栓系融合过程,同时根据上述研究结果,Ypt31/32和胞吐复合体均在蛋白酶A的外分泌过程中发挥重要作用,由此初步证实酿酒酵母中蛋白酶A在胁迫条件下的外分泌过程与细胞的组成型分泌途径密切相关。