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目前在肝脏的原发性肿瘤中,肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,IC C)的发病率近年来逐渐攀升,仅次于肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。由于肝内胆管癌(ICC)和肝细胞肝癌(HCC)的病理类型以及发病机制不同,其起病过程更为隐匿,病程发展更为迅速,而且预后极差。基于肝内胆管癌以上特点,很多患者确诊时已经失去手术时机,而且一些接受过手术的病人,术后很快出现了复发甚至病灶的全身转移,不再适合二次手术。化学治疗(化疗)是这些晚期病人常见且重要的治疗方式。目前对于肝内胆管癌的化疗是以吉西他滨为基础的治疗方案,但是由于吉西他滨化疗有效率低,很多病人化疗效果不佳,出现耐药现象。因此我们希望通过肝内胆管癌组织建立的人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived xenografts,P DX)模型中筛选出一些能够预测化疗的血清学标志物或者对于化疗增敏的分子,从而有助于临床病人的筛选或者治疗。基于以上问题,我们首先进行了目标分子的筛选以及它化疗效果的验证,并对其现象背后可能存在的生物学机制进行了探究。第一部分Thrombospondin-1(TSP1)的表达水平能反映肝内胆管癌(ICC)对吉西他滨化疗的敏感性研究目的:应用人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived xenografts,PDX)模型,筛选出能够反映肝内胆管癌对于吉西他滨化疗敏感性的目标分子,并通过临床样本验证目标分子的表达水平能否反映化疗敏感性。研究方法:建立PDX模型后,通过吉西他滨药敏实验筛选出了化疗敏感组以及耐药组的模型,利用转录组以及蛋白芯片技术在不同组别PDX模型中筛选出了目标分子;进一步通过PCR,免疫组化等方法在不同PDX模型中进行目标分子表达水平的验证;以及应用ELIAS、免疫组化等技术,通过临床样本验证目标分子的表达水平能否反映出ICC患者对于吉西他滨化疗的敏感性。研究结果:应用转录组测序和蛋白芯片技术对于不同组别的PDX模型检测后,我们发现吉西他滨化疗敏感组模型中TSP1的表达水平显著高于耐药组,后续通过PCR以及免疫组化技术证实TSP1在转录组水平和蛋白水平上均有显著差异。在临床队列中,我们发现TSP1的表达水平与吉西他滨化疗药物的敏感性相关,组织中或血清中TSP1的高水平能够预测吉西他滨较好的化疗效果和较长的生存时间。研究结论:TSP1在化疗敏感组织中表达水平明显高于耐药组织,在以吉西他滨为基础药物进行化疗的肝内胆管癌病人中,发现TSP1的表达水平与吉西他滨化疗药物的敏感性相关,组织中或血清中TSP1的高水平能够预测吉西他滨较好的化疗效果,病人的生存获益。第二部分Thrombospondin-1(TSP1)增强吉西他滨对肝内胆管癌的化疗效果研究目的:由于TSP1的表达水平与吉西他滨的化疗敏感性相关,本研究拟考查TSP1在吉西他滨化疗中的生物学作用。研究方法:利用TSP1重组蛋白,通过对其单独应用以及和吉西他滨联合应用,在细胞水平通过CCK8、EDU、以及克隆形成实验探索其对于肝内胆管癌细胞系(HCCC9810以及RBE)的生物学功能;又进一步建立裸鼠皮下荷瘤模型在动物水平去验证TSP1对于肝内胆管癌的生物学作用,以及TSP1能否对于吉西他滨的化疗起到增敏的效果。研究结果:CCK8、EDU以及克隆形成的结果均显示TSP1重组蛋白本身对于肝内胆管癌细胞的生长并没有起到抑制作用,但是TSP1重组蛋白联合吉西他滨一起使用时的效果比单独使用吉西他滨的化疗效果要好;而且在动物水平,我们通过对于裸鼠的皮下荷瘤实验得到了和细胞水平类似的实验结果,发现TSP1组荷瘤小鼠(单独应用TSP1)和空白对照组荷瘤小鼠相比,肿瘤的大小和生长速度并没有显著的统计学差异;但是TSP1+吉西他滨组荷瘤小鼠(TSP1和吉西他滨联合使用)的作用效果要好于吉西他滨单药组,前者荷瘤小鼠肿瘤的大小和生长速度受到明显抑制。研究结论:细胞实验以及动物实验证实了TSP1可以作为吉西他滨的化疗增敏剂,在联合吉西他滨一起应用时效果要比吉西他滨单独作用的疗效更好。第三部分TSP1可抑制肝内胆管癌细胞对油酸的摄取,从而增加吉西他滨的治疗效果研究目的:文献报道TSP1和CD36结合后会影响脂肪酸的摄取,而且由于脂代谢的异常会影响吉西他滨的化疗效果,本部分研究拟探索在肝内胆管癌中,TSP1是否会通过影响脂肪酸代谢促进了吉西他滨的化疗敏感性。研究方法:应用代谢组学对差异脂肪酸的筛选(实验组在肝内胆管癌细胞系加入TSP1重组蛋白,对照组加入生理盐水)。利用CCK8、EDU、克隆形成等实验同时在其它肝内胆管癌细胞系验证此脂肪酸对于吉西他滨化疗的影响,以此来确定在肝内胆管癌细胞中,此脂肪酸的变化是否能对吉西他滨化疗的效果产生影响;然后通过油红染色实验确定TSP1是否会影响肝内胆管癌细胞对于此脂肪酸的摄取,进一步检测此脂肪酸相关的代谢产物,进一步证实TSP1是否通过影响脂代谢增加了吉西他滨的化疗效果。研究结果:代谢组学的检测筛选出油酸作为差异脂肪酸,通过在细胞系验证发现TSP1会抑制肝内胆管癌细胞对于油酸的摄取。并且我们通过细胞功能学实验发现油酸的加入会减弱吉西他滨的药物疗效,进一步对于油酸代谢产物的检测,发现了导致吉西他滨药物抵抗的相关代谢产物ATP以及ROS水平的增加;而加入TSP1后会使得细胞对于油酸的摄取减少,其相关的代谢产物ATP以及ROS水平也会随之下降,增强吉西化疗的化疗效果。研究结论:TSP1可以通过抑制肝内胆管癌细胞对于油酸的摄取,提高了吉西他滨的化疗效果,起到了化疗增敏剂的作用。