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目的
1．研究细脚拟青霉多糖的结构特征；
2．探讨细脚拟青霉多糖的免疫活性及其构效关系。
方法
1．采用用水提、乙醇沉淀及Sevag法除蛋白分离提取细脚拟青霉总多糖(tPTPS)。以DEAE-纤维素-52离子交换柱对细脚拟青霉总多糖进行分组，收集主要组分(PTPS)。
2．以CellCountingKit8(CCK-8)分析PTPS对小鼠脾细胞增殖活性的影响；以酶法和RT-PCR方法检测PTPS对小鼠腹腔巨噬细胞(PM(I))一氧化氮(NO)的产生和iNOSmRNA表达的影响。
3．用SephadexG100凝胶柱对PTPS进一步纯化，收集纯化组分PTPS-I。采用紫外扫描、高效液相色谱法(HPLC)进行纯度和分子量测定。
4．采用气相色谱法(GC)分析PTPS-I单糖组成，高碘酸氧化、部分酸水解、红外光谱(IR)以及核磁共振(NMR)分析PTPS-I的结构特征。
5．体外培养人外周血单个核细胞(MNC)72h，以CCK-8试剂比较分析PTPS-I在部分酸水解前后对MNC增殖活性的影响；PTPS-I直接与肿瘤红白血病细胞株K562，喉癌细胞Hep2和肝癌细胞SMMC-7721共培养24h，用CCK-8检测PTPS-I的细胞毒作用；收集PTPS-I与MNC培养48h的上清(PTPS-I-MNC)，与K562细胞，Hep2细胞和SMMC-7721细胞共培养72h后，用CCK-8检测肿瘤细胞的增殖活性；以不同浓度的PTPS-I诱导MNC6h后，用Trizol提取总RNA，实时荧光定量PCR检测细胞因子TNF-amRNA和IL-6mRNA的表达。
结果
1．细脚拟青霉总多糖(tPTPS)为褐色粉末状固体，经DEAE-纤维素一52离子交换柱层析分组，收集第l峰的组分PTPS，冷冻干燥后为白色粉末状固体。
2．PTPS能促进体外培养的小鼠脾细胞增殖，增强小鼠腹腔巨噬细胞产生NO和iNOSmRNA的表达。
3．PTPS-I纯度为98．977％，不含蛋白和核酸。分子量为1．84x104D，由甘露糖和半乳糖(13：1)组成，含有α-和β-构型的糖苷键，主链主要由α-(1→6)-Man、a-(1→2)-Man、p一(1→3)-Man和α一(1→6)-Gal及少量p一(1→6)-Gal组成；侧链由α一(1→3)-Gal和6-(1→3)-Gfl组成；末端为p—D-Gal。
4．PTPS-I水解前后，在300mg／L和500mg／L浓度时均能促进MNC增殖，二者比较没有显著差异。
5．当PTPS-I浓度达到500mg/L时，其对K562细胞，Hep2细胞和SMMC-772l细胞没有直接的细胞毒作用。
6．PTPS-I在300mg/L和500mg~浓度时的PTPS-I-MNC能抑制肿瘤细胞Hep2和K562的增殖；在500mg/L浓度时的PTPS-I-MNC抑制肿瘤细胞SMMC-7721的增殖。
7．PTPS-I在一定浓度范围内时能显著增强TNF-αmRNA(100mg/L～500mg/L)和IL-6mRNA(30mg/L～500mg／L)的表达，并显现剂量依赖效应。
结论
1．PTPS能促进小鼠脾细胞增殖，增强小鼠腹腔巨噬细胞产生NO和iNOSmRNA的表达，提示PTPS具有免疫调节作用。
2．PTPS-I是由甘露糖和半乳糖组成的杂多糖分子，分子结构为：
(1)主链含a．(1→6)-Man、Q一(1→2)-Man、p一(1→3)一Man和α一(1→6)-Gal及少量p一(1→6)一Gal；v(2)侧链含α-(1→3)-Gal和β-(1→3)-Gfl；(3)末端为p．D．Gal。
3．PTPS-I无细胞毒作用，具有免疫调节活性，通过免疫调节发挥抗肿瘤作用。
4．PTPS-I的主链结构在免疫调节活性中可能发挥主要作用。