背景子宫肉瘤(Uterine sarcomas, US)是继宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌之后的女性生殖系统第四大恶性肿瘤,随着诊断技术的不断改进和发展,其发病率有逐年上升的趋势。子宫肉瘤生长迅速、侵袭性强、远处转移早,难于治疗且容易复发及耐药。多年来,对其治疗方案的探索一直是研究的重点。手术是子宫肉瘤首要的治疗方法,而辅助放化疗对残余肿瘤细胞的杀伤性也不容忽视。盆腔及宫腔内放疗可以显著降低子宫肉瘤的局部复发率。Wataru Yamagami等在对常规化疗药物(阿霉素、异环磷酰胺和顺铂)治疗子宫肉瘤疗效的回顾性分析指出,不同化疗药物单用或联用反应率和疾病控制率不一致,联合用药能显著延长患者生存期。遗憾的是,越来越多的证据表明,化疗药物的广泛应用加速了子宫肉瘤多药耐药现象(Multidrug resistance, MDR)的出现。细胞对某种药物产生耐药的同时,对其他分子结构及作用机制完全不同的药物也产生交叉耐药的现象称之为多药耐药。研究表明,多药耐药产生机制复杂,而目前研究最为广泛的耐药机制由MDR1基因编码P-糖蛋白(P-glyprotein, P-gp)过度表达所介导。P-gp是一种分子量较高的细胞表面糖蛋白,属于ATP结合转运蛋白超家族成员之一,具有能量依赖性药物外排的作用,在ATP供能的前提下,可将化疗药物泵出细胞外,从而降低胞内化疗药物蓄积量。RNA干扰技术是美国科学家安德鲁·法尔(Andrew Z Fire)和克雷格·梅洛(Craig Mello)发现的能够精确沉默转录后靶基因表达的热门研究工具,21-25 bp的小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)是整个RNA干扰过程中起核心作用的分子,具有级联放大的靶基因沉默效应,非常适用于阻滞肿瘤细胞或组织中异常或突变蛋白的表达。目前,siRNA靶向沉默MDR1基因逆转多药耐药的研究已在头颈鳞癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌等肿瘤的治疗中得到了证实。然而,裸露的siRNA难以被细胞摄取导致转染效率低下,其次易被体内外核酸酶降解导致半衰期短、稳定性差。因此,安全高效的递送载体有助于siRNA顺利进入细胞发挥治疗作用。siRNA药物递送载体系统研究主要分为病毒载体以及非病毒载体,从国际上已经进入临床试验阶段并具有一定成药性的基因治疗药物来看,新型非病毒载体材料已成为主流(如阳离子脂质体和阳离子聚合物)。目前生物医药领域研究及应用最为广泛的一类阳离子聚合物聚酰-酰胺(Polyamide-amine,PAMAM),以乙二胺为核,采用发散法通过迭代的Michael加成和酰胺化反应所合成。近年来,PAMAM因其独特的分子结构和表面特性(纳米级尺寸、内部大空腔、单分散性、多价性、可以量身定制的高密度表面功能基团等)在递送DNA、 siRNA、寡核苷酸等基因物质方面所表现出来的潜能吸引了越来越多科研人员的注意。在生理条件下表面携带有正电荷的PAMAM分子,通过静电吸引力与表面带有负电荷的siRNA分子相结合,将siRNA分子包裹在内使之免受核酸酶降解并通过内吞作用促进细胞摄取,有利于siRNA分子顺利参与RNA干扰过程,实现靶基因沉默的目的。目前,PAMAM递送siRNA至细胞内用于靶向沉默前列腺癌热休克蛋白表达、抑制艾滋病毒复制等取得较好疗效。研究表明,某些受体在肿瘤细胞表面特异性表达或过度表达,因此,利用受体与对应配体的特异性结合,可将药物分子选择性递送至受体过度表达的肿瘤细胞中,谓之为受体介导的肿瘤靶向给药系统,此法可以显著提高药物输送的有效性和靶向性。PAMAM分子高密度表面功能基团为肽、生物素等的修饰提供了丰富的作用位点,进而利用受体-配体结合的特异性提高PAMAM分子递送的靶向性。目前研究较为广泛的靶点主要包括EGFR、 Her2分子等。已有研究证实,通过对PAMAM表面功能基团进行活性多肽EGF修饰,可将siRNA分子特异性递送至细胞表面过度表达EGFR的肿瘤细胞中,这为受体介导的PAMAM分子靶向递送核酸类物质提供了广阔的应用前景。但在子宫肉瘤细胞中,是否可以通过EGF-PAMAM递送系统将靶向MDR1基因的siRNA递送至细胞中,探讨其特异性沉默MDR1基因及其下游分子表达,进而联合临床化疗药物发挥其促进细胞凋亡等生物学作用,这些都有待于进一步证实。因此,本课题拟以子宫肉瘤耐药细胞(MES-SA/DX5)为研究对象,设计靶向EGFR的PAMAM-siRNA递送系统,利用自组装技术构建高效低毒EGF-PAMAM-MDR1-siRNA复合物,通过RNAi技术下调MDR1基因的表达逆转多药耐药现象,同时联合临床经典化疗药物紫杉醇,观察siRNA类基因物质联合化疗药物对子宫肉瘤耐药细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。目的1、通过分子自组装技术构建高效靶向基因复合物EGF-PAMAM-MDR1-siRNA;2、考察EGF-PAMAM-MDR1-siRNA基因复合物在MES-SA/DX5中的入胞情况；3、考察MDR1基因的体外沉默效应(mRNA和蛋白水平)；4、联合临床经典化疗药物紫杉醇,考察基因物质联合化疗药物对MES-SA/DX5细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法1、基因复合物的制备：根据实验室前期研究结果,基因复合物PAMAM表面胺基与siRNA表面磷酸基团的最佳比例(N/P)为20：1,siRNA:EGF修饰物质量比=2：1。将EGF、 PAMAM、 siRNA分别与相应体积的Opti-MEM混匀,分别制成对应的A、B、C液。制成PAMAM-MDR1-siRNA二元基因复合物,则将B液缓慢加入C液中,轻轻混匀,室温静置20 min。制成EGF-PAMAM-MDR1-siRNA三元基因复合物,则将A液缓慢加入B液与C液的混合物中,室温静置20 min。2、基因复合物的细胞转染及其对细胞生长状态的影响：MES-SA/DX5细胞铺板至相应培养板,置于37℃、5% CO2培养箱中孵育过夜。弃旧培养基,1×PBS与Opti-MEM培养基各清洗一次细胞,将据1所述方法制备的基因复合物加入细胞培养板,6h后换完全培养基,置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养18h或42 h。于转染后0 h、6 h、24 h、48 h后,将细胞置于倒置显微镜下观察细胞生长状态。3、激光共聚焦显微镜(Confocal)考察基因复合物的入胞：所用siRNA经Cy5标记。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育18 h后,弃旧培养基,加入Honechest 33342染液1 mL/孔,孵育10 min后于Zeiss LSM 710倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察Cy5-siRNA进入MES-SA/DX5细胞情况。4、 RT-PCR、 Western Blot、流式细胞术和Confocal考察基因复合物对MES-SA/DX5细胞中MDR1基因的沉默效应：所用siRNA为MDRl-siRNA。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育42 h后收集所有的细胞,或提取所有细胞的RNA或蛋白。所提取的RNA逆转录为cDNA继而进行聚合酶链式反应,经核酸电泳后分析MDR1基因mRNA表达情况。所提取的蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显色后分析P-gp蛋白表达情况。所收集的细胞直接加入FITC标记的鼠抗人P-gp IgG,4℃暗处孵育30 min后立即用流式细胞仪检测P-gp蛋白的平均荧光强度。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育42 h后弃旧培养基,加阿霉素溶液(ADM) 500 μL/孔(10μg/mL)继续孵育4h后弃ADM加Honechest 33342染液500μL/孔孵育10 min,经Zeiss LSM 710倒置金属激光扫描共聚焦显微镜观察MES-SA/DX5细胞对ADM的摄取情况,侧面验证MDR1基因的沉默效应。5、 Western Blot检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2,Caspase-3)表达的影响：经基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞,联合应用Taxol溶液孵育48 h后提取所有细胞的蛋白。所提取的蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显色后分析Bcl-2, Caspase-3蛋白表达情况。6、CCK-8检测不同浓度基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞增殖毒性的影响：所用siRNA浓度分别为2,5,10 μg/mL所用Taxol浓度分别为5,10 μg/mL经不同浓度基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞,联合应用Taxol溶液孵育24 h、48 h后,加入CCK-8 10 μL/孔继续孵育4h后经酶标仪检测MES-SA/DX5细胞吸光度值,根据公式分析MES-SA/DX5细胞增殖毒性情况。7、流式细胞术检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞周期、细胞凋亡的影响：经基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞,联合应用Taxol溶液孵育24 h、48 h后收集所有细胞,经洗涤、染色后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况和细胞凋亡情况。8、细胞划痕实验检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞迁移能力的影响：先制备细胞划痕模型,经基因复合物转染6h后的细胞划痕模型,联合应用Taxol溶液后孵育24 h。于转染后采用Olympus (1X73)倒置显微镜拍照,分别采集转染后Oh,6h,12 h,18 h,24 h这5个时间段细胞图像,经Olympus cellSens Dimension软件分析MES-SA/DX5细胞迁移变化情况。结果1、经分子自组装技术构建的EGF-PAMAM-MDR1-siRNA复合物基本不影响MES-SA/DX5细胞生长状态,能显著提高siRNA分子的细胞摄取率；2、通过EGF-PAMAM递送的siRNA,能有效沉默MES-SA/DX5细胞MDR1基因mRNA和蛋白水平的表达；3、 EGF-PAMAM-MDR1-siRNA复合物联合经典化疗药物Taxol作用后,可显著抑制MES-SA/DX5细胞的增殖、迁移,使MES-SA/DX5细胞更多阻滞于S期,显著提高细胞凋亡比例。结论综上所述, PAMAM作为一种新型的非病毒载体材料,能够有效将siRNA分子递送至子宫肉瘤细胞,进而沉默MES-SA/DX5细胞中MDR1基因mRNA和蛋白水平的表达,经EGF修饰后,沉默效应更为显著,联用化疗药物Taxol后,细胞凋亡比例可显著提高。MDR1基因在子宫肉瘤的多药耐药中起着至关重要的作用,有望成为治疗耐药性子宫肉瘤的有效靶点,而通过EGF-PAMAM递送靶向MDR1基因的siRNA可能是逆转子宫肉瘤多药耐药的有效途径。