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非选择性阳离子通道 TRPV2(Transient Receptor Potential Vanilloid 2)属于瞬时受体电位通道家族中的一员,广泛表达于多种神经和非神经细胞。TRPV2通道由于能够响应包括机械力、温度、渗透压、生长因子、激素和内源性大麻素等在内的多种刺激,因而被称为多觉感受器。TRPV2通道在维持细胞的正常功能中发挥重要作用,研究表明其功能的异常会导致一系列相关疾病的发生。TRPV2通道由于分布广泛且在生理病理中具有重要功能,因而针对其功能调节的研究成为了目前该领域的研究热点,但至今仍未见特异性调节TRPV2通道功能的激动剂或抑制剂的报道。此外,由于TRPV2通道的温度激活阈值高达52℃,而如此高的温度刺激也很难在机体组织内完成。靶向TRPV2通道功能调节手段的匮乏严重阻碍了 TRPV2通道的研究进展。针对这一困境,本研究旨在寻找调节TRPV2功能的内源性调节亚基或配体亚基,以期丰富TRPV2通道的功能的调节手段。我们首先建立了小鼠背根神经节cDNA文库,以TRPV2通道的胞内区N端作为筛选的诱饵蛋白,借助酵母双杂交的方法筛选小鼠背根神经节中与TPRV2通道内源性的互作蛋白,经过酵母双杂交筛选、基因测序和生物信息学分析共得到36种与TRPV2通道的N端有潜在相互作用的候选文库蛋白。磷酸化与去磷酸化是蛋白质翻译后修饰中的一对可逆的反应过程,在蛋白质的功能调节中具有重要作用,如介导蛋白质-蛋白质相互作用、调节蛋白酶活性、控制蛋白质的亚细胞定位,并影响蛋白质稳定性。研究结果表明离子通道活性同样受磷酸化与去磷酸化调控。因此,我们选择了候选蛋白中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ARaf(Serine/threonine-protein kinase ARaf)作为本研究的关键候选蛋白。ARaf作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要通过磷酸化下游信号分子将信号从膜受体传递到胞内,在细胞增殖和分化等功能的调节中起关键作用。磷酸激酶ARaf是否通过与TRPV2通道蛋白互作并磷酸化TRPV2通道而调节通道功能?我们开展了一系列的相关实验,所取得的研究结果包括:1)酵母回转和免疫共沉淀实验证实了 ARaf和TRPV2通道的N端以及全长均有互作。此外,Hek293T细胞中共表达的TRPV2与ARaf共聚焦结果显示二者在亚细胞水平有共定位。2)免疫印迹结果显示,ARaf的存在能显著增加TRPV2通道丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平。3)膜片钳全细胞模式记录结果显示,共表达TRPV2通道与ARaf时,TRPV2对激动剂2-APB的敏感性降低,浓度依赖性曲线发生右移。5)点突变筛选结果显示,共表达 ARaf 时,TRPV2 通道 S65A,S466A,T522A,S526A 点突变对 2-APB 的敏感性并无显著变化,表明S65,S466,T522,S526位点在ARaf对TRPV2的磷酸化调节中起重要作用。综上所述,本论文的研究结果表明丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶ARaf不仅与TRPV2通道蛋白互作,并有效提高通道蛋白的磷酸化水平。筛选得到位于胞内侧的4个关键氨基酸残基为ARaf磷酸化TRPV2通道的潜在效应位点。ARaf通过磷酸化修饰TRPV2通道蛋白而下调通道活性,降低通道对激动剂的敏感性。我们的研究结果丰富了 TRPV2通道功能的调节手段,并对类似研究具有较为重要的参考价值。而前期酵母双杂交筛选得到的多个候选蛋白也为后续研究打下了良好基础。