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猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是近三十年来给全球养猪业造成严重影响的传染性疾病之一,主要以妊娠母猪的繁殖障碍及仔猪出现呼吸系统症状为特征。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）,该病毒具有抗原频繁变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement,ADE）及持续感染性等特点,现有的疫苗尚不具备很好的保护力。近年来,国内高致病性PRRSV的流行给养猪业造成巨大的经济损失,虽然目前已有大量对其致病机制的研究,但随着抗原变异和相关受体的不断发现,该病具体的致病机制依旧留有些许空白。N蛋白是由相对保守的PRRSV ORF7编码的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,在保护病毒RNA及病毒复制、转录和病毒粒子的装配过程中发挥重要作用。早期研究表明N蛋白是PRRSV感染过程中产生最多的结构蛋白,可以在感染早期诱发机体产生大量特异性抗体。同时也有研究发现使用杆状病毒表达的N蛋白作为亚单位疫苗免疫宿主后,可对PRRSV野毒感染产生一定的保护作用,此外,也有研究证实识别N蛋白上特定表位的抗体可在病毒感染其天然靶细胞PAMs的过程中介导ADE效应。基于这些前期结论我们推测在PRRSV感染过程中可能存在分泌性核衣壳蛋白,本研究将进一步探讨在PRRSV感染宿主细胞过程中N蛋白可能发挥的其他作用,研究内容主要如下:1. PRRSV ORF7基因的克隆及其原核表达与纯化鉴定根据PRRSV-SD16毒株的核苷酸序列设计引物,经过PCR方法以PRRSV-SD16感染性克隆为模板用Q5?High-Fidelity DNA Polymerase通过PCR扩增出ORF7目的片段,将片段克隆至p ET28a原核表达载体上。经测序正确后转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,利用IPTG诱导其表达,通过SDS-PAGE电泳鉴定N蛋白在上清中获得良好表达,并在罗氏Ni Resin填料中达到理想的纯化效果。经Western blot验证纯化后的N蛋白与PRRSV抗体阳性猪血清存在特异性反应,表明N蛋白具有良好的反应原性。2. PRRSV阳性猪血清中抗N蛋白多抗的纯化及PRRSV-N蛋白双抗夹心ELISA方法的建立将经纯化的PRRSV-N蛋白偶联至CNBr-activated Sepharose TM 4B填料后与PRRSV阳性猪血清孵育吸附,利用甘氨酸（p H 2.4）特异性洗脱后得到猪血清中只识别N蛋白的抗体。经SDS-PAGE电泳分析获得的猪抗PRRSV-N蛋白多克隆抗体具有良好的纯度,Western blot验证该多抗与感染PRRSV-SD16毒株的Marc-145细胞裂解液、PRRSV-VR2332毒株纯化病毒粒子及重组表达N蛋白均具有特异性反应,同时与未感染PRRSV的Marc-145细胞及猪ISG15蛋白无反应,表明PRRSV阳性猪血清中抗N蛋白的多抗纯化成功。以实验室自制的PRRSV-N蛋白特异性单克隆抗体（克隆号:PP7EF11）为捕获抗体,纯化后猪抗PRRSV-N蛋白多克隆抗体为检测抗体,Marc-145、CRL-2843CD163及PAMs细胞感染PRRSV-JXA1毒株及未感染细胞的培养上清为待检样品,同时将重组N蛋白作为阳性对照,Goat anti-Swine Ig G HRP为酶标二抗进行双抗夹心ELISA检测。通过优化主要条件后检测结果表明在Marc-145、CRL-2843CD163及PAMs细胞感染PRRSV-JXA1毒株的细胞培养上清中存在N蛋白,提示在PRRSV感染过程中被感染细胞可能通过分泌或其他途径释放游离的核衣壳蛋白。3. 探究PRRSV-N蛋白与PAMs细胞膜蛋白的结合利用生物素-亲和素吸附的原理将PRRSV-N蛋白偶联生物素后与PAMs孵育并加入APC标记的链霉亲和素标记荧光,流式细胞术分析结果表明N蛋白可吸附于PAMs细胞膜,同时对照组SUMO蛋白及未加蛋白组均无反应。将经纯化的PRRSV-N蛋白偶联至CNBr-activated Sepharose TM 4B填料与提取的PAMs膜蛋白孵育,特异性洗脱后进行银染分析并截取特异性蛋白电泳条带进行质谱分析,鉴定发现N蛋白在PAMs细胞膜上的特异性作用蛋白为唾液酸粘附素CD169。4. PRRSV-N蛋白作用于PAMs后细胞因子及趋化因子表达水平的变化将去内毒素后的PRRSV-N蛋白作用于PAMs进行预处理,再加入TLR3受体激动剂Poly（I:C）刺激,利用实时荧光定量PCR检测PAMs炎性因子表达,结果表明N蛋白预处理PAMs会显著增强Poly（I:C）在其后诱导的IFN-?1、IFN-?、IL-6及IL-12的上调水平,提示PRRSV-N蛋白可能致敏PAMs细胞。本研究表明在PRRSV感染过程中有分泌性核衣壳蛋白产生,且N蛋白与PAMs细胞膜蛋白上的CD169蛋白存在互作,这种作用有可能致敏PAMs细胞,使得PAMs细胞对次级感染的天然免疫应答能力增强,可能引发炎性因子风暴,对于进一步探究PRRSV的致病机制提供新思路。