苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种可以产生芽胞的革兰氏阳性细菌。其主要特点是在芽胞形成的同时产生由不同杀虫晶体蛋白（ICPs）组成的伴胞晶体。伴胞晶体的多样性赋予Bt广谱的杀虫活性,因而Bt制剂是目前世界上应用最广泛的微生物杀虫剂。环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）是在细菌体内发现的一种核酸类第二信使。c-di-GMP普遍存在于原核生物细胞中,其介导的信号转导系统可以与其他信号调控网络交叉互作,共同调控菌体的运动与固着方式的转变、生物膜的形成、细胞分化以及毒力因子的表达等多种生物学功能。细胞内c-di-GMP的合成与降解分别受到具有GGDEF或GGEEF保守结构域的二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase,DGC）和具有EAL或HD-GYP保守结构域的磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）所催化。本课题在已完成全基因组测序的苏云金芽胞杆菌BMB171菌株中发现2个编码含GGDEF结构域蛋白的基因（C3708和C5008）以及7个编码GGDEF和EAL双结构域蛋白的基因（C0469、C0550、C3200、C3420、C4901、C4944和P0180）。我们选取合成酶基因C3708和C5008作为研究对象,对C3708基因及C5008截短基因（保留其GGDEF结构域,删除其跨膜结构域）进行克隆、表达、纯化。经HPLC检测及质谱鉴定,我们发现C3708蛋白具备c-di-GMP合成酶活性,而C5008截短蛋白c-di-GMP合成酶活性不高,主要产生中间产物ppp Gp G。利用本实验室构建的c-di-GMP生物传感器,我们进一步在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中验证了C3708和C5008的c-di-GMP合成酶活性。另一方面,我们发现C0550蛋白（在体外具有c-di-GMP降解酶活性）在体内也具有微弱的c-di-GMP合成酶活性。通过将C3708的GGDEF结构域的每一个氨基酸逐个突变,我们发现除AGDEF外,其它点突变蛋白的c-di-GMP合成酶活性完全丧失,说明这些位点对于DGC活性的贡献不同。利用同源双交换结合三亲本杂交法,我们分别获得了△C3708和△C5008单敲除突变株,以及△C3708△C5008（△2dgc）双敲除突变株。通过进一步探索相关菌株的表型,我们发现与BMB171出发菌株相比:△C3708无明显变化,△C5008敲除菌株的运动性增强,而△2dgc的运动性增强、生物膜形成减少。同时,我们发现△2dgc菌株胞内c-di-GMP浓度与BMB171出发菌株相比有大幅降低,这表明C3708和C5008基因共同调节体内c-di-GMP的浓度从而促进菌体运动,抑制胞外基质的分泌,和（或）加速生物膜的解离。另一方面,我们发现虽然C4944截短蛋白在体外既不具有c-di-GMP合成酶活性也不具有c-di-GMP降解酶活性,但敲除菌株△C4944与BMB171出发菌株相比,其体内c-di-GMP水平有显著上升,运动性明显减弱,生物膜形成增强,芽胞形成推迟。此外,通过测定相应基因的启动子活性及RT-PCR实验,我们确定了C3708、C5008及C0550的转录情况,并鉴定出可能参与C5008转录调控的sigma因子。我们认为,苏云金芽胞杆菌中c-di-GMP信号分子可以调节菌体的运动性、细胞膜的形成、胞外基质的产生等多种生理活动。C3708、C5008及C4944基因在c-di-GMP的合成和降解过程中发挥着重要的功能。我们的工作为深入探究c-di-GMP在苏云金芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌群乃至革兰氏阳性菌细菌中的代谢情况及其可能参与的代谢调控奠定了基础。