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非生物胁迫,如盐、干旱、低温等对植物特别是有经济价值的农作物的生长发育会产生不利影响。盐胁迫是主要的非生物胁迫之一,全球有20%的土地受到盐碱化的影响,植物在盐碱化严重的土地上几乎不能生存。有证据表明,到2050年将会有50%的土地受盐碱化的影响,植物的生长和发育状况以及农作物的产量也会因此而受到影响。植物在几百万甚至几亿年的繁衍过程中,逐渐形成一系列抵御盐胁迫的机制,如渗透调节、减少生长量、抗氧化系统的防御等,其中渗透调节在植物耐盐过程中起着重要的作用。调节植物渗透势的物质由无机和有机渗透调节物组成,其中有机渗透调节物包括脯氨酸、甜菜碱、糖和有机酸等。植物中含有大量有机酸,在调节离子平衡和p H值的过程中发挥着重要作用。苹果中主要的有机酸是苹果酸,占苹果中有机酸总量的90%,在植物代谢及多种发育过程中发挥着重要作用。ALMT(Aluminum-activated malate transporters)家族基因可以编码苹果酸转运蛋白,该家族基因对于苹果酸在植物体内的积累和运输至关重要。同时,ALMT家族基因在植物应对非生物胁迫、调节气孔运动、种子发育等过程中发挥着重要作用。前人对ALMT基因的研究主要集中在气孔运动的调节、铝离子抗性及果实品质的形成等方面,对该家族基因在应对非生物胁迫方面的研究不多。本研究以拟南芥中At ALMT1为诱饵,通过BLAST(The Apple Gene Function&Gene Family Data Base version 1.0)获得苹果中21个Md ALMT基因,并进行进化树分析以及生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR对21个Md ALMT基因进行盐胁迫响应分析,发现Md ALMT14响应盐胁迫最明显,因此选择该基因作为探索植物耐盐机理的主要研究对象。通过农杆菌转化系统获得Md ALMT14转基因苹果愈伤组织及转基因拟南芥(Md ALMT14-1,2,3),利用Md ALMT14过表达的转基因苹果愈伤组织和拟南芥揭示Md ALMT14在植物耐盐过程中的作用。具体工作及结果如下:1.苹果Md ALMT基因的生物信息学分析和对盐胁迫的响应分析对苹果ALMT蛋白进行跨膜结构域分析,发现多数苹果ALMT蛋白含六个跨膜结构域,少数不含跨膜结构域。所有苹果ALMT都是亲水性蛋白,亚细胞定位结果显示Md AMLT在线粒体、胞质及质膜上均有定位。分析Md ALMT基因对盐胁迫的响应,发现Md ALMT14表达量变化最明显,其次为Md ALMT9like1、Md ALMT11.1和Md ALMT11.2。2.苹果Md ALMT14可以提高植物耐盐性利用农杆菌介导的遗传转化获得Md ALMT14转基因拟南芥,对幼苗及成苗进行NaCl处理,发现转基因拟南芥耐盐性高于野生型;对Md ALMT14过表达及野生型苹果愈伤组织进行不同浓度的盐处理,发现转基因愈伤组织耐盐性明显高于野生型。3.苹果Md ALMT14通过促进苹果酸的积累提高植物耐盐能力对野生型和Md ALMT14转基因拟南芥进行盐处理,发现转基因拟南芥耐盐性高于野生型,并且转基因拟南芥植株在盐胁迫下积累更多的苹果酸;对野生型及Md ALMT14转基因愈伤组织进行不同浓度的NaCl处理,发现转基因愈伤组织具有更高的耐盐能力,同时随着NaCl浓度的升高,野生型及转基因愈伤组织积累越来越多的苹果酸,但Md ALMT14转基因愈伤组织的苹果酸含量始终高于野生型。以上结果说明Md ALMT14通过促进苹果酸的积累提高植物耐盐性。4.Md ALMT14影响耐盐相关基因的表达检测NaCl处理下野生型及Md ALMT14转基因拟南芥中与耐盐相关的基因(At SOS1、At SOS2、At SOS3、At CBL5、At NHX1)的表达量,发现野生型拟南芥植株中耐盐相关基因的表达量比转基因拟南芥中的表达量低;检测盐处理后愈伤组织中与耐盐相关基因(Md SOS1、Md SOS2、Md SOS3、Md CBL1、Md NHX1)的表达量,发现野生型苹果愈伤组织中耐盐相关基因的表达量比Md ALMT14转基因愈伤组织中的表达量低。以上结果表明,Md ALMT14对植物耐盐相关基因的表达水平有影响。5.Md ALMT14影响离子平衡对野生型及Md ALMT14转基因拟南芥成苗进行高盐处理,检测各植株中Na+、K+含量,发现盐胁迫下转基因拟南芥K+/Na+值高于野生型拟南芥,猜测Md ALMT14可能通过调节离子平衡调节植物耐盐性。