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背景:动脉粥样硬化（AS）是一种由血管损伤、固有免疫以及脂质浸润等多种因素引起的慢性炎症性疾病,其终末表现为斑块的形成与破裂,能够引起心肌梗死、不稳定心绞痛、卒中、外周血栓等多种心脑血管不良事件,严重危害了人类健康。miR-145是一种微小RNA,在心血管疾病中具有保护性作用。目前已经证明,AS血管壁中miR-145水平持续性降低,然而其具体机制仍未明确。本研究拟从DNA水平,通过检测组织以及细胞中的miR-145启动子甲基化状态,阐明其调控机制。进一步探讨miR-145的异常甲基化参与AS斑块发生的作用及其机制。研究目的:1.检测不同程度斑块以及TNF-α处理的平滑肌细胞中miR-145启动子区甲基化状态。2.筛选参与调控miR-145甲基化的相应甲基化酶或蛋白。3.体内、体外水平使用5-aza（5-氮杂-脱氧胞嘧啶核）抑制甲基化后观察miR-145表达变化。4.明确miR-145下游参与AS发生的靶基因。研究方法:1.动物分组及样本获取8周龄ApoE-/-小鼠分为0、6、12、18、24周组,每组6只。分别给予高脂饮食饲养相应周数后使用CO2麻醉法处死小鼠,分离并获取小鼠升主动脉至腹主动脉处血管,包埋切片用于组织染色。其余部分用于DNA、RNA或蛋白提取。2.细胞培养和处理小鼠主动脉平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）通过原代培养获得。细胞以含10%FBS的D-MEM/F12培养基在37℃含5%CO2条件下培养。根据不同实验要求,细胞给予10ng/ml TNF-α处理24小时,或者TNF-α+5-aza（5μmol/ml）处理48小时。在CD137相关实验中,VSMC先使用TNF-α（10ng/ml）预处理24小时增高膜表面CD137后,加入CD137L重组蛋白（10μg/ml）激活CD137通路。3.5-aza处理ApoE-/-小鼠8周龄ApoE-/-小鼠高脂饲养12周后随机分为5-aza处理组和生理盐水处理组分别腹腔注射5-aza（0.25mg/kg,每周3次）或等量生理盐水,并持续高脂饲养12周。同时以C57BL/6小鼠高脂饲养24周作为野生型对照（WT）。4.亚硫酸盐修饰后基因测序（BSP）与甲基化特异性PCR（MSP）提取组织或细胞DNA后,使用亚硫酸盐进行修饰后通过基因测序检测miR-145启动子区甲基化位点。通过MethPrimer设计针对特定甲基化位点的MSP引物。采用PCR结合琼脂糖凝胶电泳分析单个位点甲基化状态。5.形态学染色、免疫组化及免疫荧光小鼠主动脉切片使用Masson染色鉴定斑块面积以及坏死核心比例,通过Mac3免疫组化代表斑块内炎症水平6.蛋白质印迹技术（Western blot）通过Western blot技术对相应蛋白指标CD137、DNMT3a、DNMT3b、TET2、DNMT1及NFATc1在细胞以及组织中进行半定量。7.染色质免疫共沉淀（ChIP）使用Ch IP技术获得与TET2或DNMT1蛋白相结合的染色质,提取DNA后通过普通PCR或荧光定量PCR检测mi R-145启动子与相应蛋白结合能力。8.RNA提取以及定量PCRTrizol法提取组织或细胞中总RNA,使用加尾逆转录法获得cDNA检测检测miR-145表达。使用普通逆转录法获得cDNA用于检测其他基因RNA水平。9.真核基因过表达以及沉默载体构建通过PCR以及分子克隆构建真核过表达载体p3×FLAG-NFATc1-3’UTR、p3×FLAG-NFATc1、p3×FLAG-CD137-3’UTR和p3×FLAG-CD137用于验证miR-145的靶点。构建Plenti-NFATc1和PLKO.1-sh-NFATc1慢病毒载体用以分别过表达、沉默NFATc1。Plenti-TET2载体用来过表达TET2。10.双荧光素酶报告基因实验将含有miR-145靶位点的CD137或NFATc1的3’-端非编码区及相应突变序列构建到Psicheck2载体中,通过共转染miR-145拟似物或抑制物并检测荧光活性验证目的基因靶点。11.酶联免疫吸附测定（ELISA）采用ELISA法检测细胞培养基上清或小鼠血清中IL-1β含量。研究结果:1.ApoE-/-小鼠主动脉中miR-145表达水平随着斑块程度增高而下降Masson染色以及Mac3免疫组化显示,在0,12,24周高脂饲养的小鼠中斑块程度不断增高,坏死核心增大且炎症程度增多。Q-PCR显示组织中miR-145表达水平随着斑块进展不断下降。2.斑块血管以及TNF-α刺激下VSMC中miR-145启动子区甲基化程度增高BSP以及MSP显示,miR-145启动子区甲基化水平随着斑块程度进展不断增高,另外TNF-α模拟炎症环境同样可以诱导VSMC中mi R-145启动子高甲基化的形成。3.DNMT1和TET2介导了炎症中mi R-145启动子的异常甲基化发生通过筛选甲基化相关蛋白发现,DNMT1和TET2在斑块血管以及炎症处理的VSMC中表达量以及活性明显改变,而通过沉默表达DNMT1或过表达TET2后均可逆转miR-145启动子的高甲基化,使其表达增高。4.CD137/NFATc1通路是miR-145下游的靶基因通过生物信息学预测我们发现CD137/NFATc1可能是miR-145的下游靶基因。在VSMC中转入miR-145的拟似物或抑制物分别能够显著降低和升高CD137/NFATc1两蛋白的表达。通过构建相应靶点的载体证明了CD137/NFATc1是miR-145的下游靶基因。研究结论:炎症通过DNMT1和TET2介导VSMC中miR-145启动子区异常高甲基化抑制其表达,从而使下游CD137/NFATc1信号通路激活促进斑块形成。