β-细辛醚是中药石菖蒲挥发油部位的主要成分,对中枢神经系统具有较强的药理作用。我们前期的实验表明,β-细辛醚对帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)模型大鼠的活动能力具有改善作用,其作用途径为:促进c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)/B 淋巴细胞瘤基因 2(B-celllymphonma gene 2,Bcl-2)/Beclin-1通路作用。自噬是一种程序性的死亡方式,在PD治疗中起重要作用。但β-细辛醚联合左旋多巴(Levdopa,L-dopa)是否通过影响多巴胺(Dopamine,DA)关键酶来增加脑DA的含量来改善PD症状?对PD大鼠血浆和脑中神经递质在48 h内的动态变化情况?它作用机理是怎么样?β 细辛醚联合L-dopa是否通过调节自噬的作用来改善PD?主要影响自噬哪个步骤?这些问题有待研究。本实验主要由6个部分组成,第一部分:β-细辛醚联合L-dopa对正常大鼠的单胺类神经递质的影响,探讨联合用药对哪些神经递质有作用;第二部分:β-细辛醚联合L-dopa对正常大鼠的单胺类神经递质在48h内的动态变化,探讨联合用药对不同部位的神经递质在哪个时点作用明显;第三部分:β-细辛醚联合L-dopa对6-羟基多巴(6-hydroxydopa,6-OHDA)诱导PD模型大鼠的单胺类神经递质的影响,探讨联合用药对PD模型大鼠是否存在协同的药效作用;第四部分:β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的影响,探讨联合用药对PD模型大鼠BBB的作用;第五部分:β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠的Beclin-1、自噬微管相关蛋白轻链3B(light chain 3B,LC3B)和p62的影响,探讨联合用药对PD模型大鼠巨自噬的作用;第六部分:β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠的分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)的影响,探讨联合用药对PD模型大鼠CMA的作用。第一部分实验目的:研究β-细辛醚联合L-dopa对正常大鼠的单胺类神经递质的影响方法:将40只SPF级的SD大鼠随机分为4组,每组10只,雌雄各半,即正常组,美多巴组(75 mg/kg体质量),L-dopa组(60 mg/kg体质量)和联合组(L-dopa 60 mg/kg体质量+-细辛醚15 mg/kg体质量),按5mL/kg体质量灌胃给药,一天2次,给药7天。正常组给予等量的生理盐水。末次给药lh后,麻醉固定,取各只大鼠的腹主动脉血,灌注排血后取纹状体,采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测血浆和纹状体中L-dopa、DA、3,4-二羟基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、高香草酸(Homovanillic acid,HVA)和5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)的含量,酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆和纹状体中酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH),儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)和单胺氧化酶-B(Monoamineoxidase B,MAO-B)的含量,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色纹状体作组织病理学观察。结果:1纹状体中神经递质的变化与正常组比较,美多巴组、L-dopa组和联合组纹状体中的L-dopa、DA、HVA和5-HT的含量显著增加(P<0.05);美多巴组和联合组纹状体中的DOPAC的含量显著增加(P<0.05)。与L-dopa组比较,美多巴组纹状体中L-dopa和HVA的含量显著增加(P<0.01);联合组纹状体中DOPAC的含量显著增加(P<0.01)。与美多巴组比较,联合组纹状体中L-dopa含量显著减少(P<0.01),DOPAC的含量显著增加(P<0.01)。2血浆中神经递质的变化与正常组比较,美多巴组、L-dopa组和联合组血浆中的L-dopa、DA、DOPAC和HVA的含量显著增加(P<0.01);但各组血浆中5-HT的含量都无显著性差异。与L-dopa组比较,美多巴组血浆中DA的含量显著减少(P<0.05);联合组血浆中DA、DOPAC和HVA的含量显著增加(P<0.05或P<0.01)。与美多巴组比较,联合组血浆中DA、DOPAC和HVA的含量显著增加(P<0.01)。3病理情况与正常组比较,美多巴组、L-dopa组和联合组的神经元数量都有所增加。结论:β-细辛醚联合L-dopa具有增加正常大鼠纹状体和血浆中L-dopa、DA、DOPAC和HVA的含量及保护脑神经元的作用。第二部分实验目的:研究β-细辛醚联合L-dopa对正常大鼠的单胺类神经递质在48 h内的动态变化方法:将20只SPF级SD大鼠随机分为5组,每组4只,雌雄各半,即对照组(0h)、1 h组、5 h组、18 h组和48 h组。除对照组外,其他4组都给予L-dopa(60 mg/kg体质量)和β-细辛醚(15 mg/kg体质量),灌胃给药,一天2次,给药1天。而对照组,按5 mL/kg体质量灌胃给予等量的生理盐水,一天2次,给生理盐水1天。按给药后时间点取材,用HPLC检测48 h内血浆和脑组织(纹状体,皮质和海马)中L-dopa、DA、DOPAC、HVA 和 5-HT 的含量,用 ELISA 检测 48 h 内 TH、COMT、MAO-B和多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase,DDC)的含量。结果:1脑组织和血浆中神经递质的变化在纹状体中,L-dopa在5h内含量变化明显,其中在1h迅速增加,1-5h急速减少至正常水平,5-48 h含量稳定。DA在48 h内含量都较高,其中1-5 h含量较高,1-18 h有下降趋势,但18-48 h含量有所增加。DOPAC在5 h内含量变化明显,其中1 h含量增加较多,5-18 h降至低于正常水平,在48 h恢复至正常水平。HVA在5 h内含量变化明显,其中1h含量增加较多,5-48 h含量明显降低,但较稳定高于正常水平。5-HT在48 h内含量稳定。在皮质、海马和血浆中,L-dopa、DA、DOPAC和HVA的含量变化趋势大体相似,1 h的含量迅速增加,1-5 h迅速下降并保持与正常水平相近,5-48 h含量稳定。5-HT在48 h内含量稳定。2相关酶的动态变化2.1纹状体TH在1-5 h内含量变化明显,其中1 h增加较多,5-48 h恢复至正常水平;DDC在48 h内含量增加较多,其中5 h含量最高;COMT在48 h内都低于正常水平;MAO-B的含量在48 h内都低于正常水平并呈下降趋势。2.2血浆TH在1-5 h含量变化明显,其中1 h增加较多,5-48 h恢复至正常水平;DDC在48 h内含量增加较多,其中5 h含量接近正常水平;COMT在48 h内含量逐渐下降并低于正常水平。结论:β-细辛醚联合L-dopa可能通过增加DDC的活性来提高纹状体和血浆中DA含量;纹状体DA的含量在48 h内均维持较高水平;能抑制纹状体中COMT和MAO-B的活性来减慢DA的代谢,血浆中则促进DA代谢。第三部分实验目的:研究β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠的单胺类神经递质的影响方法:定位于SPF级SD大鼠左脑的内侧前脑束(Medial forebrain bundle,MFB)[前囟后(Antero-posterior,AP):-4.4 mm,中线旁(Medio-lateral,ML):-1.2 mm,硬膜下(Dorso-ventral,DV):-7.8 mm)],注射 6 μ L 的 6-羟基多巴(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)(4mg/mL),造模1个月后,将造模大鼠腹腔注射0.5 mmg/kg的阿扑吗啡(Apomorphine,APO),大鼠向健侧旋转数大于7圈/min为成功PD模型。假手术组是以同样的造模方式在MFB注射含0.02%抗坏血酸的生理盐水。70只PD大鼠随机分为7组,每组10只,雌雄各半,即模型组,美多巴组(75mg/kg体质量),L-dopa组(60 mg/kg体质量),β-细辛醚组(15 mg/kg体质量),联合低、中、高剂量组[L-dopa60mg/kg体质量+ β-细辛醚(7.5,15,30mg/kg体质量)]。给药组按上述剂量灌胃给药,一天2次,给药30天;而假手术组和模型组,按5 mL/kg体质量灌胃同等剂量的生理盐水,一天2次,持续30天。给药第29天检测旷场实验,转棒实验和前肢实验。末次给药lh后,腹主动脉取血,迅速分离纹状体和中脑。通过HPLC检测纹状体和血浆中单胺类神经递质含量;肝肾的生化指标和病理变化;ELISA检测纹状体和血浆中DDC,COMT,TH;免疫组化法检测中脑TH;透射电镜观察DA神经元形态;免疫荧光法检测纹状体DDC。结果:1行为学结果与假手术组比较,模型组大鼠的移动格子数减少(P<0.05),站立次数减少(P<0.05),粪便粒数减少(P<0.05),中央格停留时间延长(P<0.05),转棒停留时间减短(P<0.05);与模型组比较,美多巴组,L-dopa组,β-细辛醚组和联合低剂量组大鼠的移动格子数增加(P<0.05),站立次数增加(P<0.05),粪便粒数增加(P<0.05),中央格停留时间缩短(P<0.05),转棒停留时间延长(P<0.05);与L-dopa组比较,联合中高剂量组大鼠的移动格子数显著增加(P<0.05),联合高剂量组大鼠的粪便粒数和转棒停留时间显著增加(P<0.05),联合中高剂量组大鼠的中央格停留时间都显著缩短(P<0.05);与美多巴组比较,联合高剂量大鼠的移动格子数显著增加(P<0.05),中央格停留时间显著缩短(P<0.05),而站立次数、粪便粒数和转棒停留时间无显著差异(P>0.05)。左前肢的启动时间,运动时间和运动步数在各组都无显著差异;与假手术组比较,模型组大鼠的右前肢启动时间延长(P<0.05),运动时间延长(P<0.05);与模型组比较,美多巴组和联合各剂量组大鼠的右前肢启动时间缩短(P<0.05),运动时间减少(P<0.05);与L-dopa组比较,联合高剂量组大鼠的右前肢启动时间和运动时间都显著缩短(P<0.05),运动步数显著增加(P<0.05);与美多巴组比较,联合高剂量组大鼠的右前肢启动时间,运动时间和运动步数均无显著性差异(P>0.05)。2单胺类神经递质在纹状体中的变化情况与假手术组比较,模型组大鼠的L-dopa、DA、DOPAC和HVA含量都显著减少(P<0.05);与模型组比较,美多巴组和联合各剂量组大鼠的L-dopa和DA含量都显著增加(P<0.05),各给药组大鼠的DOPAC、HVA和5-HT含量都无显著差异;与L-dopa组比较,联合各剂量组大鼠的L-dopa含量显著增加(P<0.01),联合高剂量组大鼠的DA、DOPAC、HVA和5-HT含量显著增加(P<0.05);与美多巴组比较,联合各剂量组大鼠的L-dopa含量显著减少(P<0.01),联合高剂量组大鼠的DA、DOPAC、HVA和5-HT含量均无显著性差异。3单胺类神经递质在血浆中的变化情况与假手术组比较,模型组大鼠的L-dopa、DA、DOPAC、HVA和5-HT含量显著减少(P<0.05);与模型组比较,美多巴组,L-dopa组,β-细辛醚组和联合各剂量组大鼠的L-dopa、DA、DOPAC、HVA和5-HT含量都显著增加(P<0.05);与L-dopa组比较,联合各剂量组大鼠的L-dopa、DA、DOPAC、HVA和5-HT含量都显著增加(P<0.05);与美多巴组比较,联合中高剂量组大鼠的L-dopa、DA、DOPAC和HVA含量都显著减少(P<0.05),5-HT含量无显著性差异。4肝肾生化指标的结果与假手术组比较,模型组大鼠的肌酐(Creatinine,CR)含量显著增加(P<0.01),尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)含量显著增加(P<0.05),天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST),丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和总胆红素都无显著性差异;与模型组比较,美多巴组大鼠的AST含量显著增加(P<0.01),CR和BUN含量显著减少(P<0.01),L-dopa组大鼠的ALT和CR含量显著增加(P<0.01),BUN含量显著减少(P<0.01),联合各剂量组大鼠的CR和BUN含量显著减少(P<0.05);与L-dopa组比较,美多巴组和联合高剂量组大鼠的AST、ALT、CR和BUN含量都显著减少;与美多巴组比较,联合各剂量组大鼠的AST、ALT、CR和BUN含量都无显著性差异。5相关酶的含量变化在纹状体中,与假手术组比较,模型组大鼠的MAO-B、COMT和TH含量显著减少(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠的MAO-B,COMT和TH含量都显著增加(P<0.05);与L-dopa组比较,美多巴组和联合中高剂量组大鼠的MAO-B,COMT和TH含量都显著增加(P<0.05);与美多巴组比较,联合低剂量组大鼠的MAO-B,COMT和TH含量显著减少(P<0.05)。在血浆中,与假手术组比较,模型组大鼠的DDC、COMT和TH含量显著减少(P<0.05);美多巴组DDC含量显著减少(P<0.01),L-dopa组,β-细辛醚组和联合各剂量组大鼠的DDC含量显著增加(P<0.05),各给药组的COMT和TH含量显著增加(P<0.05);与L-dopa组比较,美多巴组和联合中高剂量组的COMT和TH含量都显著增加(P<0.05),联合各剂量组大鼠的DDC含量无显著性差异,美多巴组大鼠的DDC含量显著减少(P<0.05);与美多巴组比较,联合各剂量组大鼠的DDC含量显著增加(P<0.05),而C0MT和TH含量均无显著性差异。6肝肾病理情况各组大鼠的肝细胞沿肝管区呈放射状分布、紧凑,细胞完整,胞质均匀,无明显损伤情况;L-dopa组的肾小球有轻微萎缩,有炎症细胞浸润情况出现,其他组别的肾组织情况都属于正常范围。7 TH免疫组化结果与假手术组比较,模型组大鼠的TH阳性神经元表达显著减少(P<0.05);与模型组比较,美多巴组,L-dopa组,β-细辛醚组和联合各剂量组大鼠的TH阳性神经元表达都显著增加(P<0.05);与L-dopa组比较,联合中高剂量组大鼠的TH阳性神经元表达显著增加(P<0.05);与美多巴组比较,L-dopa组和B-细辛醚组大鼠的TH阳性神经元表达显著减少(P<O.05),而联合各剂量组大鼠的TH阳性神经元表达无显著性差异。8电镜观察结果模型组大鼠的DA神经元细胞器少,核膜曲折,核仁消失;给药治疗后大鼠的DA神经元核膜曲折度减少,细胞器增多,核内染色体增多。9 DDC的表达情况与假手术组比较,模型组大鼠的DDC表达显著减少(P<0.05);与模型组比较,β-细辛醚组和联合各剂量大鼠的DDC表达都显著增加(P<0.05),美多巴组和L-dopa组大鼠的DDC表达都无显著性差异。结论:β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠具有增强DDC活性的作用来增加DA含量,抑制脑COMT和MAO-B活性减少DA代谢和保护多巴胺神经元及肝肾组织的作用。第四部分实验目的:研究β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠的P-gp和BBB的影响方法:PD模型方法同前。假手术组是以同样的造模方式在MFB注射含0.02%抗坏血酸的生理盐水。40只SPF级PD模型大鼠随机分为4组,每组10只,雌雄各半,即模型组,L-dopa组(60mg/kg体质量),β-细辛醚组(15mg/kg体质量),联合组(L-dopa 60mg/kg体质量+ β-细辛醚15mg/kg体质量)。给药组按上述剂量灌胃给药,一天2次,给药30天。而假手术组和模型组,按5 mL/kg体质量灌胃同等剂量的生理盐水,一天2次,持续30天。末次给药1 h后,冰上迅速分离纹状体和皮质。HPLC检测L-dopa、DA、DOPAC和HVA含量;流式细胞术检测皮质P-gp、紧密连接蛋白(Zonula occludens 1,Z0-1)、紧密连接相关蛋白(Occludin)和肌动蛋白(Actin)含量;免疫组化检测P-gp和紧密连接相关蛋白5(Claudin-5);免疫荧光检测ZO-1。结果:1纹状体中L-dopa、DA、DOPAC、HVA的HPLC检测结果与假手术组比较,模型组大鼠纹状体中L-dopa、DA、DOPAC和HVA水平都显著降低(P<0.05);与模型组比较,联合组大鼠纹状体中的L-dopa、DA、DOPAC和HVA水平都显著提高(P<0.05),L-dopa组大鼠纹状体中DA、DOPAC和HVA水平显著提高(P<0.05);与L-dopa组比较,联合组大鼠纹状体中L-dopa和DA含量显著增加(P<0.05),β-细辛醚组大鼠纹状体中DA水平显著降低(P<0.01),联合组大鼠纹状体中DOPAC和HVA水平显著降低(P<0.05)。2 P-gp,ZO-l,Occludin,Actin 的流式检测结果与模型组比较,β-细辛醚组和联合组大鼠的P-gp、ZO-1、Occludin和Actin的蛋白表达都显著减少(P<0.05);与L-dopa组比较,β-细辛醚组和联合组大鼠的P-gp、ZO-1、Occludin和Actin的蛋白表达都显著减少(P<0.05)。3 P-gp、Claudin-5的免疫组化结果与假手术组比较,模型组大鼠的P-gp和Claudin-5阳性表达显著减少(P<0.05);与模型组比较,L-dopa组,β-细辛醚组和联合组大鼠的P-gp和Claudin-5阳性表达显著减少(P<0.05)。4 Z0-1的免疫荧光结果与假手术组比较,模型组大鼠的ZO-1表达显著减少(P<0.01);与模型组比较,L-dopa组,β-细辛醚组和联合组大鼠的ZO-1表达显著减少(P<0.01)。结论:β-细辛醚联合L-dopa提高PD模型大鼠的纹状体中L-dopa和DA含量的这一作用可能与其能增加BBB通透性和降低P-gp表达的作用有关。第五部分实验目的:研究β-细辛醚与L-dopa联合应用对6-OHDA诱导PD模型大鼠的自噬因子Beclin-1,LC3B,p62 的表达影响方法:将SPF级SD大鼠在MFB部位注入6-OHDA制备PD模型。假手术组是以同样的造模方式在MFB注射含0.02%抗坏血酸的生理盐水。将成功的PD模型大鼠随机分为模型组,雷帕霉素组(自噬激活剂,1 mg/kg体质量),3-甲基腺嘌呤(3-Methyl adenine,3MA)组(自噬抑制剂,500nmol/只),美多巴组(75mg/kg体质量),L-dopa组(60 mg/kg体质量),β-细辛醚组(15 mg/kg体质量)和联合组(L-dopa 60 mg/kg体质量+-细辛醚15 mg/kg体质量),给药30天,每天2次。而假手术组和模型组,按5 mL/kg体质量灌胃给生理盐水,一天2次,给生理盐水30天。给药末次lh后,麻醉并灌注各组大鼠,取中脑做蛋白印迹法,免疫荧光和流式检测Beclin-1、LC3B和p62的表达,透射电镜观察DA神经元的自噬情况。结果:在蛋白印迹法,免疫荧光,流式细胞术3种检测方法中,与假手术组比较,模型组大鼠的Beclin-1和LC3B蛋白表达显著增加(P<0.01),而p62蛋白表达显著减少(P<0.01);与模型组比较,美多巴组,L-dopa组,β-细辛醚组和联合组大鼠的Beclin-1和LC3B蛋白表达显著减少(P<0.05),而p62蛋白表达显著增加(P<0.05),其中β-细辛醚组和联合组大鼠的Beclin-1和LC3B蛋白表达显著低于美多巴组和L-dopa组(P<0.05),而β-细辛醚组和联合组大鼠的p62蛋白表达显著高于美多巴组和L-dopa组(P<0.05)。在透射电镜中,与模型组比较,美多巴组,L-dopa组,β-细辛醚组和联合组大鼠的自噬活动都较弱。结论:β-细辛醚与L-dopa联合应用能减少6-OHDA诱导PD大鼠模型中脑的自噬因子Beclin-1和LC3B表达的作用,同时增加p62的表达。第六部分实验目的:观察β-细辛醚联合L-dopa对6-OHDA诱导PD模型大鼠中HSP70/MAPK/MEF2D/Beclin-1 通路的影响方法:造模方法同上,假手术组是以同样的造模方式在MFB注射含0.02%抗坏血酸的生理盐水。实验分为假手术组,模型组,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPK)抑制剂组(SB203580,0.5 mg/kg 体质量),MEF2D 激活剂组(氯化锂(LiCl),100mg/kg体质量),β-细辛醚组(15mg/kg体质量)和联合组(L-dopa 60 mg/kg体质量+β 细辛醚15 mg/kg体质量),每组10只,每天2次,给药30天。而假手术组和模型组,按5 mL/kg体质量灌胃给生理盐水,一天2次,给生理盐水30天。末次给药1 h后,冰上迅速取出造模侧的中脑,-80℃储存待用。用ELISA方法检测α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)、TH和分子伴侣介导的自噬(Chaperone mediated autophagy,CMA)相关因子[热休克蛋白 70(Heat shock cognate protein 70,HSP70)和溶酶体相关膜蛋白 2A(Lysosome-associated membrane protein-2A,LAMP-2A)];ELISA和流式细胞术方法检测肌细胞特异性增强因子2D(Myocyte enhancer factor 2D,MEF2D),HSP70 和巨自噬相关因子(Beclin-1,LC3B和 p62)。结果:与假手术组比较,模型组大鼠的α-syn、Beclin-1和LC3B的生成增加;TH、HSP70、MEF2D和LAMP-2A生成减少;p62的表达减少。与模型组比较,β-细辛醚组和联合组可促进活性HSP70和MEF2D的生成,还能减少α-syn的聚集和增加TH的生成;增加LAMP-2A的表达;减少Beclin-1和LC3B的表达,并增加p62的表达。结论:β-细辛醚与L-dopa联合应用有激活CMA作用和抑制巨自噬的作用,还能增加活性MEF2D和HSP70的生成,有助于减少α-syn的聚集和保护神经元,从而减少PD神经毒性的作用。总结论:β-细辛醚联合L-dopa具有增加正常大鼠和PD模型大鼠的纹状体和血浆中L-dopa,DA,DOPAC,HVA的含量,减少肾毒性,并能显著改善PD模型大鼠的行为能力;纹状体中DA和L-dopa含量的增加可能与联合用药能增加BBB的通透性和抑制P-gp表达作用有关;联合用药还可以通过HSP70/MAPK/MEF2D/Beclin-1通路来调控巨自噬和分子伴侣介导的自噬从而减少α-syn的聚集和增加活性MEF2D的表达,达到减轻DA神经元损伤的作用。