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人乳头瘤病毒(human papillomaviruses, HPVs)晚期蛋白1(L1)是疫苗研究的主要靶抗原。目前上市的HPV疫苗有葛兰素公司用昆虫细胞生产的HPV16、18型二价L1VLP疫苗(Cervarix)和默克公司用酿酒酵母生产的HPV6、11、16、18型四价L1VLP疫苗(Gardasil),在9-26岁年轻女性中使用,预防宫颈癌。但上述疫苗存在以下问题：价格昂贵,肌肉注射依从性差,在发展中国家使用受到限制；与宫颈癌密切相关的HPV型别较多,国外研制的疫苗只能预防两种高危型HPV型别引起的宫颈上皮内瘤变(CIN),因为仅抑制两种高危HPVs,其它高危HPVs有可能乘机可在宫颈繁殖,引起宫颈癌。因此,研发抗原谱广、价格低廉、使用方便的新型HPV疫苗具有重要意义。虽然乙肝疫苗的预防效果比较显著,但我国仍是乙肝高发地区。目前单独应用基因工程HBsAg免疫原性较低,需要联合佐剂才能使机体产生保护性的免疫应答,但铝佐剂乙肝疫苗诱导的细胞免疫较弱,有10%左右的人群呈无应答或低应答,并且乙肝疫苗接种次数较多,疼痛感明显,接种依从性差。因此,研究开发新型乙肝疫苗十分重要。研究表明,黏膜疫苗具有以下优点：给药途径简便,接种依从性高；可产生细胞免疫；鼻腔免疫可诱导阴道局部抗体；反复黏膜免疫可拓宽抗原保护谱；无需使用针头及注射器等潜在感染源。2007年,我国病毒生物技术国家工程研究中心北京金迪克研究所将壳聚糖与细胞因子IL-2组成复方,研发新型JY佐剂系统,以期提高疫苗免疫效果。本研究旨在探讨JY佐剂对HPV16、18L1VLP黏膜免疫效果的影响,并观察反复鼻腔免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应,以期开发新型HPV黏膜疫苗。此外,本研究亦开展了不同剂量的IL-2和壳聚糖佐剂对小鼠乙肝疫苗免疫应答的影响,及注射免疫后用粘膜免疫来加强乙肝抗体的研究。主要研究内容和结果如下：1.HPV16、18型L1病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)黏膜免疫研究用含或不含JY佐剂的HPV16、18L1VLP分别肌肉、阴道和鼻腔免疫BALB/c小鼠,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,检测血清IgG抗体滴度；于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,检测细胞免疫和黏膜免疫效果。鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,收集第14、20、26、32和38周的血清,检测HPV16、18L1蛋白免疫血清与HPV58、11和6型交叉免疫反应。1.1HPV16、18型L1VLP体液免疫效果免疫三次后,HPV16、18L1VLP经鼻腔、阴道和肌肉注射免疫均能产生特异性体液免疫反应。HPV16、18L1VLP经鼻腔免疫的IgG抗体水平低于经肌肉免疫,但高于阴道免疫,但含有JY佐剂的HPV16和18型L1VLP鼻腔免疫七次后IgG抗体水平达到其肌肉注射第三次的水平(1：20480)。另外,含有JY佐剂的HPV16、18L1VLP肌肉注射、鼻腔和阴道免疫组血清特异性IgG水平均高于不含JY佐剂的免疫组,表明JY佐剂能够提高HPV16、18L1VLP免疫后血清IgG抗体水平。1.2HPV16、18型L1VLP黏膜免疫效果免疫3次后,肌肉注射免疫组未检测至sIgA抗体,但鼻腔和阴道免疫组检测到sIgA抗体。具体结果如下：1.2.1鼻腔免疫组的黏膜免疫效果鼻腔免疫后,HPV16L1、HPV16L1+JY、HPV18LI、HPV18L1+JY、HPV16和18型L1联合免疫、HPV16和18型L1+JY联合免疫组的呼吸道灌洗液sIgA浓度分别为22.11、27.26、23.47、30.06、23.85和26.54μg/mL,与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。含有JY佐剂L1蛋白免疫组sIgA浓度高于不含佐剂组,差异有统计学意义(P<0.05),表明JY佐剂可提高HPV16、18型L1VLP鼻腔黏膜免疫效果。1.2.2阴道免疫组的黏膜免疫效果阴道免疫后,HPV16L1、HPV16L1加上JY佐剂、HPV18L1、HPV18L1加上JY佐剂、HPV16和HPV18型L1联合免疫、HPV16和HPV18型L1加上JY佐剂的联合免疫组的呼吸道灌洗液sIgA浓度分别为25.07、31.99、18.64、23.28、19.65和29.34μg/mL,与阴性对照组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。含有JY佐剂L1蛋白免疫组sIgA浓度高于不含佐剂组,且差异有统计学意义(P<.05),表明JY佐剂增强HPV16、18L1VLP阴道黏膜免疫效果。1.3HPV16、18型L1VLP细胞免疫效果免疫3次后,在鼻腔免疫和肌肉注射免疫组检测到细胞免疫反应,但在阴道免疫组未检测到。具体结果如下：1.3.1鼻腔免疫组的细胞免疫效果用HPV16L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞,HPV16L1、HPV16L1+JY、 HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组细胞斑点数分别为91±5.25、176.8±55.75、93.6±13.01和180.2±31.39。当用HPV18L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV18L1、HPV18L1+JY、HPV16/18L联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组细胞斑点数分别为90±4.95、132.2.8±11.43、109.8.6±10.18和249.8±51.51。HPV16或18型L1VLP免疫诱导的斑点数均高于PBS对照组(41.3±11.24),且差异均有统计学意义(P<0.01)。含有JY佐剂组Ll蛋白免疫组高于不含佐剂免疫组,且差异有统计学意义(P<0.01)。表明JY佐剂提高HPV16、18L1VLP经鼻腔免疫诱导细胞免疫应答。1.3.2肌肉注射免疫组的细胞免疫效果用HPV16L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV16L1、HPV16L1+JY、 HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY联合免疫组的细胞斑点数分别为75.67±10.41、80.33±12.7、74.41±13.61和94.33±33.26。当用HPV18L1VLP刺激小鼠脾淋巴细胞后,HPV18L1、HPV18L1+JY、HPV16/18L1联合免疫、HPV16/18L1+JY佐剂的联合免疫组的细胞斑点数分别为68±15.87、90.67±3.51、83.33±29.74和100±13.75。用HPV16或18型L1蛋白诱导的斑点数均高于阴性对照组(42.5±13.12),且差异均有统计学意义(P<0.05)。含有JY佐剂的L1VLP免疫组高于不含佐剂免疫组,表明JY佐剂加强HPV16、18L1VLP经肌肉免疫诱导的细胞免疫应答。1.4HPV16、18L1VLP中和抗体检测通过HPV16L1假病毒,检测到含有JY佐剂的HPV16和18L1联合鼻腔免疫后血清中和抗体滴度为1：100,其阴道免疫时血清中和抗体滴度为1：50,而不含JY佐剂组未检测到。含有和不含有JY佐剂的HPV16和18型L1VLP联合肌肉注射免疫诱导的血清中和抗体滴度分别为1：6400和1：200,表明JY佐剂诱导鼻腔和阴道免疫产生中和抗体,并提高肌肉注射免疫的中和抗体滴度。1.5HPV16、18L1VLP反复鼻腔免疫后血清抗体的交叉反应HPV16、18L1VLP与HPV58、11和6型之间均有免疫交叉反应,且在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。在第32周,HPV58型与16、18型之间IgG滴度分别高达1：131072、11：16384；HPV6型与16、18型之间IgG滴度均高达1：8192；HPV11型与16、18型之间IgG滴度分别高达1：16384、1：8192,表明HPV16、18型L1蛋白与HPV58型之间的抗体交叉反应较强,与HPV11、6型的免疫交叉反应较弱。经核苷酸序列比对发现,HPV58型L1与HPV16、18型L1基因序列的同源性分别为76%和70%；而HPV11、6型与HPV18、16的同源性为66-69%；因此,HPV16和18型L1VLP与HPV58型的抗体交叉保护作用较强,与HPV11和6型的抗体交叉保护作用稍弱。研究表明,抗原反复鼻腔免疫可扩大抗原表位识别范围,对非表位决定簇产生反应,从而对其他型别病毒提供广谱免疫保护,这与本研究所得结论一致。综上,HPV16、18L1蛋白经过反复鼻腔免疫可以拓宽抗原保护谱。JY佐剂增强HPV16、18L1VLP鼻腔免疫诱导的体液免疫、细胞免疫和黏膜抗体应答,亦能增强阴道免疫诱导的体液和黏膜免疫效,和肌肉注射免疫诱导的细胞和体液免疫反应,表明JY佐剂可成为一种有效的佐剂。2.JY佐剂对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)疫苗黏膜免疫研究将不同剂量IL-2和壳聚糖组成的JY佐剂用于乙肝表面抗原HBsAg,经检测鼻腔免疫小鼠血清IgG抗体滴度发现,20000IU IL-2/只小鼠和0.025%壳聚糖用于HBsAg抗原时,血清抗体水平最高。此外,含铝佐剂乙肝疫苗注射免疫后用含JY佐剂乙肝疫苗进行粘膜加强免疫的研究表明,0.5ug或2μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,8μg和4μg含JY佐剂乙肝疫苗鼻腔加强免疫代替其第2次或第3次含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射免疫。2μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,第2次或第3次铝佐剂肌肉注射加强免疫组诱导的抗体水平与8μg和4μg含JY佐剂乙肝疫苗鼻腔加强免疫所诱导的抗体水平相当。0.5μg含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射初免或免疫两次后,用0.5μg铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射加强免疫诱导的血清抗体水平与含JY佐剂疫苗鼻腔加强免疫的抗体水平均相当。JY是一种安全有效佐剂,可用于提高乙肝病毒疫苗黏膜免疫诱导的血清抗体水平。