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背景和目的四肢和躯干骨等大多数骨骼,均是通过软骨内成骨方式形成的。该过程从胎儿期开始,一直持续到成年早期生长停止。间充质干细胞凝集并分化为软骨细胞,然后肥大分化。血管、破骨细胞和其他骨原细胞侵入软骨,逐渐替换剩余的软骨,直至骨骼成熟。软骨内成骨是一个复杂的过程,取决于软骨细胞,血管和破骨细胞等多种细胞的协同作用。作为软骨内成骨过程中的关键细胞,软骨细胞驱动着这一过程。而破骨细胞在该过程中也是必不可少的。成骨细胞在残余软骨上沉积并替换依赖于破骨细胞的骨吸收。有研究报道,软骨细胞分泌的血管内皮生长因子调节血管生成并提高破骨细胞的存活和骨吸收。肥大软骨细胞表达软骨聚集蛋白和金属蛋白酶在软骨内成骨过程中调节破骨细胞的活性。这些细胞间通讯的发现为骨骼的生长、更新和维持提供了深刻的见解。因此,本文认为破骨细胞反过来也会作用于软骨细胞。目前没有相关的研究报道。外泌体作为细胞间通讯的一种新模式,已引起越来越多的关注。它是一种直径为40～100nm的亚细胞双层膜囊泡,通过内吞、融合和分泌形成。外泌体包含蛋白质、脂质、编码或非编码RNA等,通过将这些物质释放至靶细胞发挥功能。研究发现,成骨细胞、破骨细胞、破骨细胞前体细胞等分泌外泌体。破骨细胞来源外泌体可参与骨代谢的调节。并且,某些骨源性外泌体中的microRNAs还参与骨形成的调节,故本文拟从外泌体角度研究破骨细胞对软骨细胞的作用机制。另一方面,在软骨形成过程中,Smad蛋白在软骨细胞中普遍表达,Smad2和Smad3特异性地传递TGF-β信号。Smad介导的TGF-β途径可抑制软骨细胞肥大和矿化,有助于维持关节软骨。软骨内成骨过程中细胞间协作的失调会导致骨骼发育异常,目前还没有有效的治疗方法。因此,有必要探究伴随血管入侵的破骨细胞对生长板软骨细胞的作用,以更全面地了解软骨内成骨过程。为开发治疗骨发育异常及修复骨缺损的新方法提供实验基础。材料与方法(1)本文首先构建了胎鼠发育模型,取样制成切片进行免疫荧光染色。选取Col10a1、TRAP两个基因分别代表软骨细胞和破骨细胞,观察它们各自的定位。提取BMMs细胞,建立破骨细胞体外诱导模型。用添加100ng/ml RANKL和30ng/ml M-CSF的培养基诱导BMMs各24小时、120小时,以诱导分化为破骨细胞前体、破骨细胞,用TRAP染色进行鉴定。对ATDC5细胞、提取的MSCs细胞,用软骨诱导培养基分别诱导7天、14天,生成软骨细胞。用Transwell建立破骨细胞前体和破骨细胞与软骨细胞体外间接共培养体系,加入肥大化诱导培养基共培养。7天后,提取软骨细胞的RNA和蛋白质,进行q RT-PCR和Western blot检测与软骨分化相关的标记基因。本文还建立了条件培养体系。提取破骨细胞前体和破骨细胞的条件培养基,与肥大化诱导培养基1:1混合,培养软骨细胞7天或14天,收样检测关键的标记基因。(2)本文对破骨细胞使用外泌体抑制剂GW4869,封闭了破骨细胞条件培养基中的外泌体。还直接从破骨细胞中分离出外泌体。分别用来处理软骨细胞以观察破骨细胞来源外泌体是否对软骨细胞有作用。提取BMMs、破骨细胞前体、破骨细胞外泌体,用基因芯片检测外泌体中microRNAs的表达情况。通过分析对比,筛选差异表达的microRNAs。本文还用let-7a-5p抑制剂或对应的阴性对照转染破骨细胞,使破骨细胞外泌体中let-7a-5p的表达被抑制或不被影响。用转染后破骨细胞外泌体处理软骨细胞7天,检测软骨细胞表达的变化。同时,预测let-7a-5p潜在的靶基因并用双荧光素酶报告基因验证。结果(1)胎鼠切片中,存在软骨细胞和破骨细胞相邻甚至共定位的区域。共培养条件下,破骨细胞前体和破骨细胞对ATDC5软骨特异性标记Col2a1和Sox9的表达没有显著影响,不过两者均上调ATDC5肥大软骨特异性标记Col10a1、Runx2、Mmp13的表达。破骨细胞前体、破骨细胞的条件培养基均上调ATDC5、MSCs细胞Col10a1、Runx2、Mmp13的表达。并且,这些基因的相对表达水平在用破骨细胞条件培养基处理的软骨细胞中更高。(2)抑制破骨细胞外泌体后提取的条件培养基,对软骨细胞肥大特异基因的表达没有显著影响,而破骨细胞外泌体也可上调软骨细胞中Col10a1、Runx2、Mmp13的表达。测序筛选出在破骨细胞阶段表达显著上调的外泌体来源let-7a-5p。抑制let-7a-5p后,破骨细胞外泌体对软骨细胞肥大特异基因的表达没有显著影响。进一步地,let-7a-5p靶向Smad2使其活化减少,抑制Smad2介导的信号传导。结论破骨细胞前体和破骨细胞均可促进软骨细胞肥大化,进而促进软骨内成骨,且破骨细胞的促进效应相对更强。破骨细胞外泌体在破骨细胞促进软骨细胞肥大化中起着极其重要的作用。破骨细胞外泌体来源的let-7a-5p靶向Smad2,可削弱TGF-β通路对软骨细胞肥大的抑制作用,从而促进软骨细胞肥大化。本研究从细胞间通讯的角度丰富了对软骨内成骨的认识,可能为骨再生及组织工程技术修复骨缺损提供新的思路。