目的：长期慢性的紫外线辐射(Ultraviolet Radiation)被认为是老年性白内障形成的主要原因。有关紫外线辐射导致白内障的机制还不太清楚,国内外大量学者已从紫外线对晶状体蛋白的氧化损伤及DNA的直接损伤方面探讨了紫外线与白内障形成的关系。最近的研究表明,晶状体在无氧条件下受紫外线辐射也会出现离子平衡紊乱。因此,有人认为紫外线对调控细胞间离子平衡的膜通道也具有损伤作用。缝隙连接(Gap Junction)介导的细胞间通讯(Gap Junction IntercellularCommunication,GJIC)是细胞间主要通讯方式,GJIC允许小分子自由通过,调控细胞间离子平衡。晶状体上皮细胞间GJ是相邻的晶状体上皮细胞间缝隙连接蛋白(Connexin43,CX43)组成的。那么,UVA是否会对Connexin43产生某种方式的损伤作用呢?本研究依据以上推测,探讨Connexin43是否是uVA对晶状体损伤的潜在靶点,同时观察UVA对晶状体上皮细胞的这种损伤作用是否是可逆的,进一步分析这种损伤作用会有哪些细胞内传导通路的参与。　　 材料与方法：　　 1、细胞培养、UVA照射及测定细胞存活率细胞选取人晶状体上皮细胞SRAO1/04,培养于DMEM。UVA照射强度分别为0、5、10、20、40 J/cm2。细胞生存率由CCK-8试剂盒测定,OD450值为不可逆细胞凋亡比例。并且根据不同照射强度下晶状体上皮细胞存活率,选择UVA的最适实验强度。　　 2、测定CX43 mRNA和蛋白含量以及SLDT实验实验分组是按UVA照射和空白对照分为两组。同时UVA停止照射后,会有不同观察时间点,我们选取停止照射后的0、1、2、4、8、16小时。SRA01/04细胞经10 J/cm2 UVA照射后,按照预先设定的不同时间点,分别提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,定量real-time PCR测定细胞内CX43的mRNA含量以及停止照射后mRNA的变化趋势。SRA01/04细胞经超声裂解后,蛋白转移至PVDF膜,加入CX43抗体,运甩Western-blot方法测定CX43蛋白含量以及停止照射后的蛋白变化趋势。SLDT实验是为了测定GJIC活性。SRA01/04细胞经UVA照射后,分别加入荧光素黄(Kuciferyellow,LY)和罗丹明(Rhodamine-dextran,RD)。细胞经手术刀划痕后,分别在上述时间点由多聚甲醛固定,观察LY和RD的扩散速度,经荧光显微镜数字成像系统照像。　　 3、测定细胞内活性氧、脂质过氧化程度以及PKC活性SRA01/04细胞经UVA照射后,在上述时间点,运用流式技术测定细胞内活性氧(ROS)的含量及变化趋势,运用MDA检测细胞脂质过氧化程度及变化趋势。同样的,PKC的活性也经由上述干预因素处理后,运用PKC活性检测系统Genmed,检测PKC活性及变化趋势。　　 4、统计学方法选择实验数据用均数士标准差表示。使用SPSS13.0统计软件进行数据处理和t检验,P＜0.05认为有统计学意义。　　 结果：　　 1、不同强度的UVA对SRA01/04存活率的影响晶状体上皮细胞SRA01/04在不同强度的UVA照射后,会出现细胞存活率的改变。细胞存活率由CCK-8检测。当UVA照射强度为5 J/cm2时,细胞存活率约为80％。随着UVA照射强度的增加,细胞存活率降低。当UVA照射强度为40 J/cm2时,细胞存活率下降至20％左右。我们发现,当UVA照射强度为10 J/cm2时,细胞生存率约为46％。因此,我们把10 J/cm2作为UVA的最适照射强度,用于后续实验。　　 2、UVA对CX43的mRNA和蛋白表达的影响以及SLDT实验CX43的mRNA由定量real-time PCR测定。SRA01/04经10 J/cm2UVA照射后,CX43的mRNA明显比对照组降低。停止照射1小时后,CX43的mRNA水平开始缓慢升高,并在随后的2至8小时持续升高。停止照射后的16小时,SRA01/04细胞CX43的mRNA水平恢复至照射前的基线水平。同样的,CX43的蛋白也有上述变化。SRA01/04经10 J/cm2UVA照射后,CX43蛋白明显下降。停止照射后1小时,CX43蛋白开始缓慢升高,并在随后的2至8小时持续升高。停止照射后的16小时,SRA01/04细胞CX43的蛋白水平恢复至照射前的基线水平。这种变化说明10 J/cm2 UVA照射对细胞CX43的影响是在mRNA和蛋白两个水平,而且这种变化是可逆的。检测CX43功能的划痕实验,即SLDT实验也出现了上述同样的变化。SRA01/04经10 J/cm2 UVA照射后,可见实验组LY仅在划痕处的两侧小范围内,而对照组LY范围较大,约扩散五至六层细胞。停止照射后,实验组LY开始逐渐扩散,约16小时后,两组间无明显差别。RD因无法经CX43扩散至细胞内,两组均观察到RD停留在划痕处的两侧小范围内,两组间始终无差别。　　 3、UVA对ROS、脂质过氧化、PKC的影响我们运用流式技术检测晶状体上皮细胞SRA01/04经UVA照射后的胞内ROS变化。我们发现UVA照射可导致胞内ROS的急速上升,说明细胞内氧压力的增加。在随后的16小时内,ROS开始下降,提示胞内应激状态有所恢复。同样的,我们运用MDA检测胞内脂质过氧化程度。UVA照射后,我们检测到超过80％的MDA的升高。停止照射后的1小时和2小时,约分别有60％和40％的升高。在停止照射的16小时,脂质过氧化状态得以大部分的恢复。PKC活性在LWA照射后也存在上述变化,UVA照射后,PKC活性约有58％的升高,在随后的16小时内,PKC活性逐渐降低。说明LWA引起的PKC活性的变化是可逆的。　　 结论：　　 1、经不同强度的UVA照射,可导致晶状体上皮细胞SRA01/04存活率的变化。5 J/cm2至40 J/cm2的照射强度可导到SRA01/04存活率的变化范围为80％至20％。10J/cm2的UVA照射后,SRA01/04存活率约为46％。我们把10 J/cm2作为后续实验的最适照射强度。　　 2、UVA照射可导致CX43的mRNA和蛋白两个水平的下降,但是,这种变化是可逆的。UVA照射可导致CX43功能状态的变化,SLDT实验中,LY的扩散速率是暂时的,可逆的。说明UVA导致的CX43的功能变化是可逆的。　　 3、UVA照射可导致SRA01/04细胞内ROS和脂质过氧化的增加,说明UVA照射可以引起氧压力的变化。细胞内信号转导通路如PKC也参与了UVA照射的细胞内应激反应。更重要的是,以上指标,ROS、脂质过氧化程度和PKC活性在UVA停止照射后,逐渐复原。说明UVA引起的细胞损伤有多种信号途径的参与,而且这些变化是可逆的。