课题来源：广东省科技计划项目《多西紫杉醇和卡铂化疗序贯Gefitinib一线治疗晚期NSCLC的系列研究》(基金项目编号：20098030801035)。目的：通过系统的研究,建立Gefitinib微透析采样方法,并采用内标微透析-血药浓度联用技术进行Gefitinib的药动学研究,为抗肿瘤药物的靶向性研究提供新的思路,亦为微透析技术应用于油水难溶性及高蛋白结合型药物的药动学及药效学研究提供新的途径。方法：1建立Gefitinib HPLC分析方法采用HPLC-UV,外标法测定Gefitinib和Erlotinib生理盐水(pH3.22)及甲醇溶液浓度,并考察色谱条件的专属性、标准曲线、精密度、准确度、定量限、检测限、稳定性等。采用HPLC-UV,以Erlotinib为内标物,测定含药血浆中Gefitinib浓度,考察色谱条件的专属性、标准曲线、精密度、准确度、基质效应、稀释试验、稳定性以及血浆样品处理回收率等。2建立Gefitinib反向微透析采样方法采用浓差法(增量法、减量法)测定Gefitinib体外回收率(RR.g)及释放率(RD.g),探讨灌流液流速、灌流液pH、探针外液浓度、环境温度对RR.g的影响及体内外RR.g与RD.g的稳定性,分析讨论反向微透析技术应用于Gefitinib药动学采样的可行性。3采用反向微透析技术测定Gefitinib离体血浆蛋白结合率将微透析探针置于梯度浓度含药血浆中,以生理盐水溶液(pH3.22,含5%二甲基亚砜)为灌流液进行灌流,待探针透析及药物与蛋白结合达到平衡状态后,收集透析液测定浓度。同法,以空白血浆为探针外液,灌流含药生理盐水溶液(pH3.22,含5%二甲基亚砜),测定探针RD.g。以RD.g等价于RR.g推算Gefitinib在梯度浓度离体血浆中的蛋白结合率。4建立Gefitinib内标微透析采样方法以Erlotinib为内标物,采用浓差法(增量法、减量法)测定Gefitinib与Erlotinib体外回收率(或释放率)比值P,并探讨灌流液流速、探针外液浓度、环境温度对P值的影响及在体比值P’的稳定性,分析讨论内标微透析技术应用于Gefitinib在体药动学研究的可行性。5传统血药浓度法测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefitinib的药动学参数大鼠灌胃或尾静脉注射给予Gefitinib药液后,自眼球后静脉丛采血,以Erlotinib为内标物,HPLC法测定血药浓度。采用WinNonlin4.0.1软件对大鼠两种给药方式Gefitinib的血药浓度(C)与时间(t)数据进行拟合,推算主要药动学参数。6内标微透析-血药浓度联用技术采样测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefitinib的药动学参数以脂肪乳注射液(20%,含Erlotinib0.508μg·mL-1)为灌流液,采用内标微透析技术采集大鼠灌胃或尾静脉注射给予Gefitinib后心脏,脑部纹状体及皮下三个采样位点的游离药物,并通过HPLC测定透析液浓度。以Erlotinib释放率(RD.e)实时校正Gefitinib的RR.g,联合血药浓度法测定值,二次校正体内药物浓度。采用WinNonlin4.0.1软件对大鼠两种给药方式Gefitinib的血药浓度(C)与时间(t)数据进行拟合。7建立人肺腺癌细胞(A549)培养方法以人肺腺癌细胞(A549)为培养对象,优化确立细胞复苏,传代,冻存,移植方案,奠定局部肿瘤动物模型基础。结果：1外标法测定Gefitinib生理盐水(pH3.22)及甲醇溶液浓度的色谱条件色谱柱(DIKMA, Platisil ODS,5μm,150×4.6mm);保护柱(通用型Security GuardTM);流动相：甲醇-水[含三乙胺02.%](80：20)：流速：1.0mL·min-1;检测波长：330nm；柱温：25℃；进样量：10μL。2外标法测定Gefitinib、Erlotinib生理盐水溶液(pH3.22)浓度及内标法测定Gefitinib含药血浆浓度的色谱条件色谱柱(DIKMA, Platisil ODS,5μm,150×4.6mm);保护柱(通用型Security GuardTM);流动相：甲醇-10mmol·L-1乙酸铵(70:30)；流速：1.0mL·min-1;检测波长：330nm；柱温：25℃；进样量：10μL。3Gefitinib反向微透析采样方法参数灌流液(生理盐水,pH3.22)流速：1.0μL·min-1;采样间隔：15min,采样量：15μL。反向微透析法测得Gefitinib的RR.g与RD.g对灌流液流速呈良好一致性。RR.g与灌流液pH呈反向相关,而随探针外液温度升高而升高,对探针外液浓度变化保持恒定,且体内外日内RR.g与RD.g稳定性良好。4反向微透析技术测定Gefitinib离体血浆蛋白结合率结果Gefitinib离体蛋白结合率为(89.45±1.03)%(RSD1.16%),不同浓度组血浆蛋白结合率差异无统计学意义(P>0.05)。5Gefitinib内标微透析采样方法参数灌流液(Erlotinib生理盐水溶液,pH3.22)；流速：1.0μL·min-1;采样间隔：15min;采样量：15μL。Gefitinib与Erlotinib体外回收率(释放率)比值P相对灌流液流速、探针外液浓度、环境温度保持恒定。脑探针、血液探针、线性探针在体P值均能保持良好稳定性。6传统血药浓度法测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefitinib后的药动学参数Gefitinib灌胃或尾静脉给药后,药动学过程符合二室模型,口服绝对生物利用度为59.81%。7内标微透析-血药浓度联用技术采样测定大鼠灌胃或静脉注射给予Gefitinib后的药动学参数灌胃或尾静脉给予Gefitinib后,药动学过程符合二室模型,口服绝对生物利用度为63.07%,主要药动学参数与传统血药浓度法测得结果一致性良好。结论：1在既定的色谱条件下,Gefitinib与Erlotinib浓度与对应峰面积及二者峰面积比值线性关系良好,专属性、日内日间精密度、稳定性、基质效应、稀释试验、血浆样品处理回收率等考察指标均能满足生物样品检测要求,采用HPLC-VU法能准确稳定地对Gefitinib及Erlotinib进行定量分析。2反向微透析法在12h之内对Gefitinib的体内外释放率(回收率)能保持相对稳定,但整体呈下降趋势。同时,二者差异较大。因此,反向微透析法体外采集测定Gefitinib样品可行。而在体内实验中,以释放率代替回收率存在一定的误差,仅可实现对Gefitinib短期代谢情况的初步评价。3Gefitinib呈现高血浆蛋白结合率,在临床应用时可能出现结合药物重新分散,引起副作用或毒性。因此,应选择合适剂量,并注意监测患者血药浓度。另外,围绕提高Gefitinib游离药物浓度的新型制剂的研究具有重要意义。4以Erlotinib为内标物,进行Gefitinib回收率实时校正切实可行。但因Gefitinib油水难溶性及高蛋白结合率的特点,常规灌流液无法实现Gefitinib在体采集。因此,需对灌流液进行改性或寻找新型灌流液,以提高在体回收率。同时,需对在体P’值进一步校正。5与正常生理状态相比,受试大鼠对Gefitinib吸收清除缓慢。因此,临床使用时应考虑药物蓄积等问题。围绕提高Gefitinib生物利用度,降低毒副作用的环糊精包合物、环糊精包合物脂质体及磁性脂质体等新型静脉靶向给药系统的研究具有重要意义。6将传统血药浓度法与内标微透析技术联合,对Gefitinib回收率进行两次实时校正,进一步提高了微透析技术应用于药物药动学研究的精准度。该联合技术可解决准确测定微透析探针在体回收率的难题,且结合药物在体蛋白结合率,即可准确推算出体内游离药物浓度。因此,可以推广应用。