论文部分内容阅读
干扰素诱导的GBPs又称p65GTPase,属于干扰素诱导的GTPase超家族,是一种重要的干扰素刺激基因(ISGs)。GBPs最早发现于1979年,Gupta发现经IFN-y刺激后,人的成纤维细胞可以产生一种67kDa的蛋白。GBP蛋白与Mx蛋白同属GTPase家族。自1979年被发现以后,后续的研究中陆续发现干扰素诱导的GBPs家族在调控细胞增殖和抵抗病原体感染方面具有重要作用。目前对干扰素诱导的GBPs家族的研究主要集中在人和小鼠上,大量实验证实了干扰素诱导的GBPs家族具有抵抗病毒感染的作用,但具体机制尚不明晰。目前对猪源GBPs生物学功能的研究并不多,仅有猪源GBPs可以显著抑制鼠伤寒沙门氏杆菌增殖的报道,猪源GBPs是否有抑制病毒增殖的作用目前尚无报道。PRRSV和PRV引发的疾病给世界养猪业带来巨大经济损失。本研究以猪源干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白家族中GBP1和GBP2两个成员为研究对象,研究猪GBPs对PRRSV和PRV增殖的影响,以及PRRSV和PRV感染对GBPs表达的影响,主要研究内容如下：1.猪GBP1和GBP2基因的扩增和序列分析从PK-15细胞中克隆了猪GBP1和GBP2基因的cDNA序列,其大小分别为1773bp和1776bp,这与GenBank上所报道的猪GBP1和GBP2序列基本一致,同源性分别为99.44%和99.5%。序列分析发现：猪GBP1和GBP2核苷酸和氨基酸的同源性分别为77.31%和69.20%。系统进化树分析表明：不同物种间GBP1和GBP2的同源性很高,其中猪与人的GBP1和GBP2同源性最高,这说明干扰素诱导的GBPs家族在进化上比较保守。2.猪GBP1和GBP2蛋白的结构预测通过蛋白质结构分析发现猪GBP1和GBP2具有干扰素诱导的GBPs家族的典型结构即N端可以结合GTP的球状结构域、C端α螺旋以及中间连接区域。3.猪GBP1和GBP2蛋白的真核表达及亚细胞定位构建了猪GBP1和GBP2的真核表达重组质粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2,转染PK-15细胞后通过Western blot检测发现重组质粒可以正确表达重组蛋白,其表达蛋白大小约为67kDa；转染PK-15细胞和Marc-145细胞后通过间接免疫荧光(IFA)检测,发现猪GBP1和GBP2蛋白定位于细胞质。4.猪GBP1和GBP2蛋白对PRRSV和PRV增殖的影响使用猪GBP1和GBP2的真核表达重组质粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2分别转染PAM和Marc-145细胞,并于转染后24h接种PRRSVWUH3株(MOI=0.5),接毒后24h收毒。通过相对荧光定量检测PRRSV基因组复制情况,通过病毒空斑实验检测PRRSV的增殖情况,结果证实猪GBP1和GBP2可以显著抑制PRRSV的增殖。使用不同剂量的真核表达重组质粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2转染Marc-145细胞,并于转染后24h接种PRRSV WUH3株(MOI=0.5),接毒后24h收毒,通过病毒空斑实验检测PRRSV的增殖情况,结果表明猪GBP1和GBP2对PRRSV增殖的影响具有剂量依赖性。使用猪GBP1和GBP2真核表达重组质粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2转染PK-15细胞,并于转染后24h接种PRV Ea株(MOI=1),接毒后18h收毒,通过相对荧光定量和病毒空斑实验检测PRV的增殖情况,结果证实猪GBP1和GBP2可以显著抑制PRV的增殖。使用不同剂量的真核表达重组质粒pCAGGS-HA-GBP1,和pCAGGS-HA-GBP2转染转染PK-15细胞,并于转染后24h接种PRV Ea株(MOI=1),接毒后24h收毒,通过病毒空斑实验检测PRV的增殖情况,结果显示猪GBP1和GBP2对PRV增殖的影响具有剂量依赖性。5. PRRSV和PRV感染对猪GBPl和GBP2的影响使用猪GBP1和GBP2真核表达质粒pCAGGS-HA-GBPl和pCAGGS-HA-GBP2分别转染Marc-145和PK-15细胞,分别接种PRRSV和PRV后通过间接免疫荧光实验(IFA)和DAPI核染色,在荧光显微镜下观察,接毒组和对照组中猪GBP1和GBP2均定位于细胞质,这说明PRRSV或PRV感染均不能改变猪GBP1和GBP2的亚细胞定位。以PRRSV感染PAM细胞,PRV感染PK-15细胞,通过相对荧光定量检测猪GBP1和GBP2mRNA表达情况,结果发现：PRV感染可以显著诱导猪GBP1和GBP2基因的表达,但PRRSV感染PAM细胞并不能显著诱导猪GBP1和GBP2的表达。