CML25蛋白属于钙调素类似蛋白(Calmodulin-like proteins,CMLs)家族,主要通过结合Ca2+调控花粉萌发及花粉管的生长。月季中不同倍性花粉在萌发过程存在竞争现象,CML25基因在花粉萌发不同时间以及不同倍性花粉中的差异表达,影响花粉在体内萌发的进程,可能是造成不同倍性花粉出现竞争强势的原因。利用秋水仙素诱导2n花粉,以及基因克隆、蛋白结构分析及功能预测、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记表达定位等技术对CML25基因参与调控花粉竞争强势进行研究,获得以下结论:(1)中国古老月季二倍体品种’Y18’天然存在1.39%的2n花粉,而四倍体月季’D2’((?))× ’Y18’((?))可以产生四倍体后代,比例为43.33%,说明2n花粉具有强势作用。不同处理的秋水仙素诱导’Y18’ 2n花粉发现,0.1%秋水仙素诱导3 d效果最好,诱导率可达到3.68%。对诱导2n花粉、天然2n花粉和ln花粉的超微结构进行观察,诱导2n花粉同天然2n花粉相似均较ln花粉条状纹饰更细纹路浅,孔穴少而小,近极端几乎无孔穴,这种差异符合进化的方向。(2)将’Y18’花粉与萌发6h花粉管进行转录组测序,筛选与花粉相关基因151个,其中主要参与花粉发育,花粉与柱头的识别及花粉萌发和花粉管的生长过程;月季CML基因有28个,其中CML25基因序列具有一对EF-Hand结构域,属于钙结合蛋白,参与信号转导机制,为亲水性蛋白。Ca2+可能通过环核苷酸门控离子通道(Cyclic nucleotide-gated ion channels,CNGCs)蛋白从质外体进入细胞质,作用于CML蛋白。(3)qPCR结果显示CML25基因在花粉萌发前后表达量发生变化,花粉萌发8 h表达量差异显著,此时花粉进入柱头并表现竞争强势,说明CML25基因在此阶段行使其生物功能。CML25亚细胞水平上定位于花粉细胞质和细胞壁。GFP蛋白标记CML25蛋白,发现相同萌发时间CML25蛋白在2n花粉管中表达量更高,推测与2n花粉竞争强势有关。萌发6 h,CML25在花粉管中的表达量由萌发孔到花粉管顶端呈逐渐递增的趋势,同Ca2+分布一致。加入抑制剂双酚A(Bisphenol A,BPA),ln和2n花粉均出现花粉管弯曲,顶端膨大,花粉管壁破裂,花粉管中荧光梯度消失的现象,说明BPA改变了 Ca2+的浓度以及CML25的表达,从而抑制花粉管的生长,导致生长异常。综上所述,二倍体月季和四倍体月季杂交产生43.33%的四倍体后代,体现出2n花粉的竞争强势,经过秋水仙素诱导使2n花粉百分比提高至3.96%,为后续实验提供基础材料,亚细胞定位发现CML25主要定位于花粉细胞壁与细胞质中,且在2n花粉中的表达量比ln花粉同一萌发时间中表达量高。萌发过程中,CML25主要结合Ca2+,加入双酚A会改变Ca2+浓度并抑制CML25的表达,从而影响花粉管的生长。