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研究目的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是非编码RNA中的一种,它的长度一般大于200nt。因为不具备翻译蛋白质的功能,它们经转录后大量存在于细胞核或胞浆内。大量存在的lncRNA在一段时间内被认为是无用的,但经过国内外学者大量研究发现lncRNA与肿瘤的发生、发展密切相关。之前有研究表明lncRNA AC026166.2-001在喉癌组织和转移淋巴结中的表达与癌旁组织存在差异,可作为喉癌病人诊断及预后的分子标志物。本研究进一步探讨lncRNA AC026166.2-001在喉癌细胞中的生物学作用及其发挥作用的相关机制。实验方法1.首先针对lncRNA AC026166.2-001核酸序列设计并合成过表达慢病毒包装颗粒和3条siRNA。2.应用慢病毒和小干扰技术通过转染进入喉癌细胞,对lncRNA AC026166.2-001的表达进行上调和下调。3.采用荧光定量逆转录-聚合酶反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRTPCR)验证lncRNA AC026166.2-001在喉癌细胞中上调和下调的效果。4.运用实时细胞分析仪(real-time cell analyzer,RTCA)、细胞克隆、流式细胞周期、流式细胞凋亡、划痕实验、transwell迁移实验检测lncRNA AC026166.2-001在喉癌细胞生长、增殖、凋亡、迁移中的作用。5.使用miRcode和miRDataBase网站数据库,通过的序列比对,预测可能与lncRNA AC026166.2-001存在相互作用的miRNA。6.双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA AC026166.2-001是否能与预测出的miR-24-3p相互作用,并用qRT-PCR方法检测上调lncRNA AC026166.2-001后miR-24-3p的表达变化。7.WesternBlot检测周期相关蛋白的表达变化。8.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,体内实验验证lncRNA AC026166.2-001的生物学功能。实验结果1.实时细胞分析仪(RTCA)和平板克隆实验结果显示,过表达AC026166.2-001后喉癌细胞增殖和克隆形成能力明显受到抑制。下调AC026166.2-001的表达则促进喉癌细胞增殖和克隆形成能力。2.流式细胞周期和细胞凋亡结果显示,过表达AC026166.2-001后细胞周期阻滞于G0/G1期,而且诱导喉癌细胞发生凋亡。下调AC026166.2-001则得到相反的结果。3.划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,AC026166.2-001抑制细胞迁移。4.此外,萤光素酶报告基因检测和Westernblot实验结果表明,AC026166.2-001充当miR-24-3p的分子海绵并且调节p27和Cyclin D1的表达。5.AC026166.2-001显著抑制LSCC(laryngeal squamous cell cancer,喉鳞状细胞癌)异种移植瘤的生长并促进细胞凋亡。实验结论AC026166.2-001在喉癌中起抑癌作用。从体外实验和体内实验结果中皆可得出,AC026166.2-001抑制LSCC细胞的增殖和转移并促进其凋亡,且其发挥上述功能的分子机制可能与miR-24-3p/p27通路有关。AC026166.2-001有望作为喉癌潜在的治疗靶点。