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S-层蛋白是乳酸杆菌表面的生物活性分子,具有维持细胞形态结构、抑制致病菌的黏附及免疫调节作用。巨噬细胞作为一种免疫细胞,介导非特异性免疫应答,其活化对机体免疫调节具有重要作用。研究表明脂多糖对巨噬细胞的活化刺激,能提高机体单核巨噬细胞系统的吞噬功能,激活巨噬细胞产生细胞毒素直接杀伤癌细胞,以及产生促炎性细胞因子如TNF-α、 IL-6等调节炎症反应。目前对乳酸杆菌S-层蛋白的研究主要集中在粘附定殖方面,有关S-层蛋白的免疫调节功能主要体现在减缓细胞凋亡进程、修复损伤细胞,诱导免疫细胞分泌炎性细胞因子等方面,而对乳酸杆菌的S-层蛋白介导免疫细胞的免疫功能调节机制有待深入研究。本课题的主要研究方法与结果如下:1、以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型,采用荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测S-层蛋白刺激巨噬细胞后TNF-α、 IL-10mRNA的表达情况。结果显示:S-层蛋白能显著增加巨噬细胞中TNF-α、 IL-10 mRNA的表达量(P<0.05),经PKC抑制剂Chelerythrine预孵处理的巨噬细胞,目的基因的表达量显著降低。表明S-层蛋白能通过PKC活化巨噬细胞促进炎性细胞因子的表达。2、为了研究S-层蛋白激活巨噬细胞的炎症信号途径,采用免疫荧光法测定NF-κB的核移位情况,蛋白免疫印迹(western blot)测定巨噬细胞IκBα和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平,凝胶电泳迁移检测技术(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA )分析巨噬细胞NF-κB和AP-1的DNA结合活性。结果表明:(1) S-层蛋白刺激巨噬细胞后引起IκBα的降解,NF-κB由胞浆转入核内,说明S-层蛋白能通过激活NF-κB信号通路活化巨噬细胞。(2) S-层蛋白对巨噬细胞的刺激能增加细胞中磷酸化ERK1/2的表达量,提高AP-1的DNA结合活性,阐明了 S-层蛋白能够通过PKC激活ERK→AP-1这一信号途径活化巨噬细胞。(3) S-层蛋白对巨噬细胞的活化具有双向调节作用。3、利用同位素相对标记与绝对定量(iTRAQ)技术对经S-层蛋白刺激的巨噬细胞蛋白组学进行分析,得到149种差异蛋白,其中有90%以上的差异蛋白表达上调。通过KEGG pathway筛选分别得到10条免疫相关信号通路和10条信号转导相关信号通路,并证实了 S-层蛋白激活巨噬细胞的过程涉及MAPK及NF-κB信号途径,此外还发现了另一条可能参与巨噬细胞活化的信号通路PI3K-Akt。本课题通过建立小鼠RAW264.7细胞免疫模型,研究嗜酸乳杆菌S-层蛋白在激活巨噬细胞过程中发挥的作用,及其激活细胞的信号转导途径,意在阐明S-层蛋白激活巨噬细胞发生免疫应答的机制,为嗜酸乳杆菌S-层蛋白应用于开发功能性食品、药品等提供理论依据。