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类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性、炎症性、系统性的自身免疫性疾病。该病在世界范围内普遍存在，而且病程长，持续发作等特征，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一[1]。临床治疗RA的常用药物多为非甾体类、糖皮质激素类等抗炎药，均具有不同程度的副作用，且需长期服用。因此从中药寻找和开发疗效好、毒副作用小的药物成为目前研究热点。但中药具有多成分、多靶点作用特点，给中药的研究带来了困难。利用代谢组学来研究生物系统的整体代谢产物的动态变化，为中药的整体作用机制研究提供了新的思路。本课题组前期镇痛、抗炎谱效学研究证明了，茜草抗炎药效物质基础为多种成分的共同作用的结果。因此，本研究利用代谢组学研究方法，初步探讨茜草抗炎的作用机制。
目的:
本研究基于UPLC-QTOF/MS方法，利用代谢组学的工具，采用佐剂性关节炎(AIA)大鼠模型，对AIA大鼠血样、尿样质谱数据进行多元统计分析，挖掘RA相关生物标志物及相关代谢通路，并结合病理生理和临床生化指标，对RCE治疗RA的抗炎作用进行初步评价。
方法:
1.RCE治疗AIA大鼠抗炎活性评价
建立佐剂性关节炎大鼠动物模型，通过足爪肿胀度、组织内脂质过氧化物和炎症因子等指标的测定，结合病理和临床生化指标，评价RCE对AIA大鼠的抗炎作用。
2.RCE治疗AIA大鼠的血样、尿样代谢组学分析
通过对大鼠血样、尿样生物样本进行样品前处理考察、分析条件优化、方法学考察，建立AIA大鼠模型血样的UPLC-QTOF/MS代谢指纹图谱。将大鼠血样、尿样质谱原始数据进行峰对齐、峰识别、归一化等预处理，再导入多元统计分析软件SIMCA-P14.0中，进行PCA、OPLS-DA分析，通过得分图(Score plot)直接地呈现不同组间的区分情况。首先，对比Con组与AIA组大鼠血样、尿样代谢情况;其次，对比各组大鼠血样、尿样在不同时间点代谢动态变化以及不同时间点各组大鼠血样、尿样代谢情况。考察药物干预后，AIA大鼠血样、尿样代谢情况，从而推测大鼠代谢物变化趋势，结合VIP值(VIP＞1)与t-test检验法(P＜0.05)，筛选差异代谢物。根据分子量和二级质谱化合物离子碎片裂解规律，通过METLIN、HMDB等在线数据库检索，对其结构进行初步鉴定。将差异代谢物在KEGGPathway、HMDB和MetaboAnalyst等数据库检索，分析RA相关的代谢通路，对茜草治疗RA的整体疗效进行综合评价，初步探讨其潜在抗炎机制。
结果:
1.RCE治疗AIA大鼠抗炎活性评价
给药后，Dex组大鼠足肿胀度显著降低(P＜0.01)，由于其不良反应致使大鼠体重增长最缓慢，RCE中和高剂量组大鼠精神状态好转，足肿胀情况较AIA组明显降低，具有统计学差异(P＜0.05、P＜0.01)。AIA组大鼠脾脏与肝脏指数明显降低(P＜0.01，P＜0.05)，给药结束后，RCE各剂量组均能明显增加肝脏和脾脏脏器指数(P＜0.01，P＜0.001)。RCE各剂量组均可以明显改善AIA大鼠肝脏、脾脏和关节组织病理损伤情况，并且RCE高剂量组效果最佳。各给药组可以明显降低AIA大鼠关节组织中TNF-α、PGE2和NO的含量(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，下调IL-1β、PGE2和P65蛋白的表达(P＜0.01，P＜0.001和P＜0.05)，上调Bax蛋白的表达(P＜0.001);RCE低和高剂量组明显降低AIA大鼠肝脏组织中MDA和MPO的含量(P＜0.05，P＜0.01)，RCE高剂量组显著增加SOD的含量(P＜0.01)，明显降低NO的含量(P＜0.01)。RCE各剂量组均可明显降低Foxp3蛋白的表达(P＜0.01，P＜0.001)。
2.RCE治疗AIA大鼠血样、尿样代谢组学分析
本研究建立了最佳血液、尿液样品前处理和UPLC-QTOF/MS分析条件。利用SIMCA-P14.0软件，对AIA大鼠血样、尿样质谱数据进行多元统计分析，随着给药时间增加，各给药组与AIA组逐渐分离，并逐渐向Con组靠近，在给药第21天时，RCE高、中和低剂量组均与AIA组明显分离，说明RCE能够逆转AIA大鼠血样、尿样代谢紊乱情况。其中，血液中共鉴定了10种生物标志物，主要涉及到了脂肪酸代谢，甘油磷脂分解代谢，色氨酸代谢、萜类骨干代谢、葡萄糖醛酸化代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等6种代谢途径;尿样中共鉴定了7种生物标志物，参与了苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化损伤和色氨酸代谢等5种代谢通路。代谢通路分析结果表明，炎症发生后，萜类骨干生物合成、脂肪酸代谢、甘油磷脂分解和嘧啶代谢等代谢通路影响值最大，受到严重的干扰，可以作为RA潜在的代谢通路，推测RCE可能通过调控四条代谢通路代谢情况来产生治疗作用。
结论:
本研究建立了AIA大鼠血样、尿样代谢指纹图谱。血样中共鉴定出10生物标志物，涉及了脂肪酸代谢，甘油磷脂分解代谢，色氨酸代谢、萜类骨干代谢、葡萄糖醛酸化代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等6种代谢途径;尿样中共鉴定了7种生物标志物，参与了苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化损伤和色氨酸代谢等5种代谢通路。其中，萜类骨干生物合成、脂肪酸代谢、甘油磷脂分解和嘧啶代谢等代谢通路影响值最大，受到严重的干扰，可以作为RA潜在的代谢通路，推测RCE可能通过调控这些代谢通路来产生治疗作用。
目的:
本研究基于UPLC-QTOF/MS方法，利用代谢组学的工具，采用佐剂性关节炎(AIA)大鼠模型，对AIA大鼠血样、尿样质谱数据进行多元统计分析，挖掘RA相关生物标志物及相关代谢通路，并结合病理生理和临床生化指标，对RCE治疗RA的抗炎作用进行初步评价。
方法:
1.RCE治疗AIA大鼠抗炎活性评价
建立佐剂性关节炎大鼠动物模型，通过足爪肿胀度、组织内脂质过氧化物和炎症因子等指标的测定，结合病理和临床生化指标，评价RCE对AIA大鼠的抗炎作用。
2.RCE治疗AIA大鼠的血样、尿样代谢组学分析
通过对大鼠血样、尿样生物样本进行样品前处理考察、分析条件优化、方法学考察，建立AIA大鼠模型血样的UPLC-QTOF/MS代谢指纹图谱。将大鼠血样、尿样质谱原始数据进行峰对齐、峰识别、归一化等预处理，再导入多元统计分析软件SIMCA-P14.0中，进行PCA、OPLS-DA分析，通过得分图(Score plot)直接地呈现不同组间的区分情况。首先，对比Con组与AIA组大鼠血样、尿样代谢情况;其次，对比各组大鼠血样、尿样在不同时间点代谢动态变化以及不同时间点各组大鼠血样、尿样代谢情况。考察药物干预后，AIA大鼠血样、尿样代谢情况，从而推测大鼠代谢物变化趋势，结合VIP值(VIP＞1)与t-test检验法(P＜0.05)，筛选差异代谢物。根据分子量和二级质谱化合物离子碎片裂解规律，通过METLIN、HMDB等在线数据库检索，对其结构进行初步鉴定。将差异代谢物在KEGGPathway、HMDB和MetaboAnalyst等数据库检索，分析RA相关的代谢通路，对茜草治疗RA的整体疗效进行综合评价，初步探讨其潜在抗炎机制。
结果:
1.RCE治疗AIA大鼠抗炎活性评价
给药后，Dex组大鼠足肿胀度显著降低(P＜0.01)，由于其不良反应致使大鼠体重增长最缓慢，RCE中和高剂量组大鼠精神状态好转，足肿胀情况较AIA组明显降低，具有统计学差异(P＜0.05、P＜0.01)。AIA组大鼠脾脏与肝脏指数明显降低(P＜0.01，P＜0.05)，给药结束后，RCE各剂量组均能明显增加肝脏和脾脏脏器指数(P＜0.01，P＜0.001)。RCE各剂量组均可以明显改善AIA大鼠肝脏、脾脏和关节组织病理损伤情况，并且RCE高剂量组效果最佳。各给药组可以明显降低AIA大鼠关节组织中TNF-α、PGE2和NO的含量(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，下调IL-1β、PGE2和P65蛋白的表达(P＜0.01，P＜0.001和P＜0.05)，上调Bax蛋白的表达(P＜0.001);RCE低和高剂量组明显降低AIA大鼠肝脏组织中MDA和MPO的含量(P＜0.05，P＜0.01)，RCE高剂量组显著增加SOD的含量(P＜0.01)，明显降低NO的含量(P＜0.01)。RCE各剂量组均可明显降低Foxp3蛋白的表达(P＜0.01，P＜0.001)。
2.RCE治疗AIA大鼠血样、尿样代谢组学分析
本研究建立了最佳血液、尿液样品前处理和UPLC-QTOF/MS分析条件。利用SIMCA-P14.0软件，对AIA大鼠血样、尿样质谱数据进行多元统计分析，随着给药时间增加，各给药组与AIA组逐渐分离，并逐渐向Con组靠近，在给药第21天时，RCE高、中和低剂量组均与AIA组明显分离，说明RCE能够逆转AIA大鼠血样、尿样代谢紊乱情况。其中，血液中共鉴定了10种生物标志物，主要涉及到了脂肪酸代谢，甘油磷脂分解代谢，色氨酸代谢、萜类骨干代谢、葡萄糖醛酸化代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等6种代谢途径;尿样中共鉴定了7种生物标志物，参与了苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化损伤和色氨酸代谢等5种代谢通路。代谢通路分析结果表明，炎症发生后，萜类骨干生物合成、脂肪酸代谢、甘油磷脂分解和嘧啶代谢等代谢通路影响值最大，受到严重的干扰，可以作为RA潜在的代谢通路，推测RCE可能通过调控四条代谢通路代谢情况来产生治疗作用。
结论:
本研究建立了AIA大鼠血样、尿样代谢指纹图谱。血样中共鉴定出10生物标志物，涉及了脂肪酸代谢，甘油磷脂分解代谢，色氨酸代谢、萜类骨干代谢、葡萄糖醛酸化代谢和不饱和脂肪酸的生物合成等6种代谢途径;尿样中共鉴定了7种生物标志物，参与了苯丙氨酸代谢、嘧啶代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氧化损伤和色氨酸代谢等5种代谢通路。其中，萜类骨干生物合成、脂肪酸代谢、甘油磷脂分解和嘧啶代谢等代谢通路影响值最大，受到严重的干扰，可以作为RA潜在的代谢通路，推测RCE可能通过调控这些代谢通路来产生治疗作用。