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研究目的通过建立甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)诱导SH-SY5Y细胞损伤模型,,从细胞及分子水平,探讨氧化应激、细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路在MGO诱导神经元损伤中的作用以及人参皂苷Rb1(简写为Rb1)的干预作用。研究方法用不同浓度的 MGO(2、1、0.75、0.5、0.25 和 0.125 mM孵育 SH-SY5Y细胞24 h,以MTT法检测细胞活力,确定细胞损伤的最佳浓度;确定造模条件后,以不同浓度的Rb1(1.5、0.75和0.375 μM)预给药8 h,然后加入MGO造模,孵育一定时间后,检测细胞活力,确定Rb1保护SH-SY5Y细胞的最佳浓度,并检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH),进一步确定Rb1的保护作用。以DCFH-DA为荧光探针检测细胞内ROS的水平,利用试剂盒测定细胞内的SOD、MDA、CAT和GSH的含量,研究Rbl对MGO引起的SH-SY5Y细胞氧化应激的影响。以Hoechst 33342/PI对细胞进行双染,利用高内涵成像系统观察细胞核的蓝染情况和细胞坏死情况;对细胞进行Annexin V/PI双染,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;以JC-1为荧光探针对线粒体膜电位进行检测;以Western blot法检测细胞凋亡的线粒体通路中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表达和PI3K/Akt通路中Akt的磷酸化水平,探究Rb1保护SH-SY5Y细胞的信号通路。并以PI3K特异性抑制剂LY294002(10 μM)预孵育后进行Rb1预给药和MGO造模,研究Rbl通过PI3K/Akt信号保护MGO诱导SH-SY5Y细胞损伤的特异性。研究结果1.随着MGO浓度的增加,SH-SY5Y的细胞活力逐渐降低。当MGO孵育24 h、浓度为0.5 mM时,细胞活力为60%左右(p<0.01),即选取0.5 mM MGO孵育24 h作为最佳的造模条件;Rbl预给药能提高细胞活力,减轻MGO对细胞的损伤,当Rb1浓度为1.5 μM时细胞活力提高至最大,与模型组相比有显著性差异(p<0.01)。Rb1预给药能剂量依赖地减少LDH的释放,其中1.5 μM Rbl对LDH释放的抑制作用最为明显(p<0.01)。2.ROS染色结果显示,MGO组绿色荧光强度显著增加(p<0.01),1.5 μM Rb1预给药后荧光强度减弱(p<0.01);并且与MGO组相比,Rbl预给药能显著逆转MGO引起的SOD、CAT和GSH活力降低和MDA水平升高(p<0.01)。3.Hoechst 33342/PI染色发现正常组细胞核呈均匀淡蓝着色,基本没有红色荧光;MGO组部分细胞核皱缩或破碎,染色不均匀,有致密的亮蓝着色,且红色荧光明显增加;Rb1预给药后细胞核形态明显改善,红色荧光比例下降。Annexin V/PI双染流式细胞仪检测结果显示,MGO能诱导SH-SY5Y细胞凋亡增加,MGO组细胞凋亡率显著高于对照组(p<0.01),Rb1能显著减少MGO诱导的细胞凋亡(p<0.01)。4.JC-1染色显示,与正常组相比,MGO组绿/红荧光比值显著增大(p<0.01);与MGO组相比,Rb1预给药后细胞绿/红荧光比值明显减小(p<0.01)。Western blot结果显示,与正常组相比,MGO组Bcl-2/Bax比例显著下降(p<0.001),cleaved Caspase-3 和 cleaved Caspase-9 蛋白水平显著升高(p<0.01),Rb1 预给药能提高Bcl-2蛋白的表达水平,显著提高Bcl-2/Bax比例(p<0.01),降低cleaved Caspase-3 和 cleaved Caspase-9 蛋白表达(p<0.01)。5.Western blot结果显示,与正常组相比,MGO组p-Akt蛋白表达水平显著下降(p<0.01),Rbl能够提高p-Akt的表达水平(p<0.01)。LY294002预孵育后,相对Rb1+MGO组,LY204002+Rb1+MGO组细胞活力显著降低(p<0.01),细胞凋亡比例显著提高(p<0.05),p-Akt水平降低(p<0.01)。研究结论1.MGO通过诱导氧化应激反应,同时抑制PI3K/Akt信号通路,下调线粒体凋亡通路中Bcl-2/Bax比例、增加Caspase家族蛋白的表达,导致SH-SY5Y细胞损伤。2.Rb1能够通过减少ROS的生成和MDA的含量,提高抗氧化酶SOD、CAT和抗氧化物质总谷胱甘肽的水平,从而有效缓解MGO诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激。3.Rbl通过调节线粒体凋亡通路中Bcl-2家族和Caspase家族蛋白的表达,抑制MGO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。4.Rb1通过提高MGO抑制的Akt磷酸化水平,活化PI3K/Akt信号通路,提高细胞活力并减少细胞凋亡。