背景与目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起急、慢性肝炎的主要病原之一,并可导致肝硬化、肝衰竭和肝癌。我国是HBV感染的高发区,约有2,300万慢性乙型肝炎患者和1.3亿无症状病毒携带者,并且有约50%的肝癌发生在我国。HBV是嗜肝DNA病毒,由双链环状DNA构成,长度约3.2kb。在HBV在复制过程中,容易发生核苷酸的错误配对,导致同一病毒核苷酸序列的差异,表现为HBV不同的基因型。迄今为止,根据HBV全基因核苷酸序列的异质性≥8%或S区基因序列差异≥4%,将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H八种基因型。在我国内地主要流行A、B、C、D四种HBV基因型,所占比例分别为1.2%、39.3%、50.2%及8.1%,且各地区流行的基因型也存在较大差异,北方地区以C型为主,约占81.6%;南方地区则以B型为主,C型也占相当比例。近年来对HBV基因型亚型的研究也逐渐开展,如Huy等通过对分别来自东南亚及远东的HBV C基因型患者基因型序列分析认为,C基因型至少可以分为HBV/C1(Cs,s代表东南亚)、HBV/C2(Ce,e代表东亚)两个亚型,其中HBV/C1型来自东南亚,如越南、泰国等,HBV/C2来自远东地区,包括日本、韩国和中国。B基因型的两种亚型分为Ba(a代表亚洲,即Asia)、Bj(j代表日本,即Japan)型。国内外研究表明HBV基因型可能与疾病进程、感染后临床表现、预后和抗病毒治疗应答等密切相关。目前普遍认为基因型C引起的炎性坏死及纤维化程度比B型更加严重,HBeAg阳性率更高,且C型与肝硬化和肝癌有关;基因型B的累积生存率要明显高于C型,基因型D容易在年轻的患者中发生原发性肝细胞癌,F型比A、D型更容易引起与肝脏疾病相关的死亡。但国内也有研究表明虽然基因型B的人群平均年龄较基因型C小,HBeAg阳性率低于基因型C,但肝功能损害和炎性及纤维化程度的差异均无统计学意义。基于此,我们以西南地区不同发展阶段的乙型肝炎患者为研究对象,研究HBV DNA、HBeAg、抗-HBe在其中的影响,研究其感染的HBV的基因型和亚型。首先回顾性分析原发性肝癌、慢性重型乙型肝炎和肝炎肝硬化等患者血清log10 HBV DNA及年龄分布;然后对部分HBV DNA定量阳性的肝癌、慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化及慢性重型肝炎患者,分析HBV基因型和亚型,了解重庆地区基因型、亚型的分布情况以及与疾病发生发展、重症化的关系。材料与方法1.选择第三军医大学附属西南医院感染病科自2000年1月～2006年9月首次住院治疗的乙型肝炎后肝硬化、慢性重型肝炎和原发性肝癌等患者为研究对象,所有患者至少1项HBV标志物阳性,并且在入院前均未进行抗病毒治疗。通过查阅病例将临床指标、实验室检查结果输入Excel表格建立数据库,用统计处理软件SPSS14.0进行处理,分析HBV复制水平对HBV相关性肝病发病的影响。2.选择2002年～2007年在西南医院感染病科住院治疗的78例原发性肝癌患者、58例肝炎肝硬化患者、20例慢性乙型肝炎患者和42例慢性重型肝炎患者分析HBV基因型及亚型对HBV相关性肝病发病的影响。所有患者均HBsAg阳性且HBV DNA >4×102copies/ml。采用罗氏法测入院时保留的库存血清的HBeAg和抗-HBe,采用多引物PCR法进行基因型分析,采用聚合酶链反应-限制性片段多肽性分析(PCR-RFLP)法进行亚型分析。结果1.226例肝癌患者、51例乙型肝炎后肝硬化患者和285例慢性重型肝炎患者,回顾性分析血清乙型肝炎病毒标志物(HBV-M)和DNA含量:其中168例肝癌患者和51例乙型肝炎后肝硬化患者接受HBV DNA定量检测,阳性率分别为85.1%、88.2%,两组患者log10 HBV DNA均服从正态分布,HBV DNA的均数为105.49±1.49 copies/ml、106.15±1.38 copies/ml,285例慢性重型肝炎患者HBV DNA均数为105.70±1.66copies/ml。三组患者log10 HBV DNA的大小依次为LC>CSH>HCC,但仅HCC组与LC组log10 HBV DNA间的差异有统计学意义(t =-2.62,P=0.01);HBeAg阳性与疾病的类型具有明显的相关性(χ~2=24.45,P<0.001),三组患者HBeAg阳性率大小依次是CSH>LC>HCC。2.在168例HBV相关性HCC患者回顾性分析:合并有肝炎肝硬化的HCC患者121例,占72%,平均年龄47.91±11.95岁,无肝硬化的HCC患者47例,占28%,平均年龄43.40±9.07岁,合并肝硬化的HCC患者明显高于无肝硬化的HCC患者(P=0.021)。两组HBeAg的阳性率也无显著差异(P=0.687)。在143例HBV DNA阳性的患者中,合并肝硬化组HCC患者的HBV DNA定量的均数为105.55±1.49copies/ml,不合并肝硬化组HBV DNA定量的均数为105.30±1.54copies/ml。两组的log10 HBV DNA无统计学差异(P=0.376)。3.HBV DNA定量阳性且HBV DNA>4×102copies/ml的78例HCC患者、58例LC患者、20例CHB患者和42例CSH患者HBV DNA定量分析和HBeAg定量分析:log10 HBV DNA的分布呈正态分布, HCC组HBV DNA定量的平均值为105.50±1.39copies/ml,肝硬化组HBV DNA定量106.18±1.10copies/ml,慢性乙型肝炎组HBV DNA定量106.20±1.10copies/ml,慢性重型肝炎组为105.83±1.54copies/ml。HCC组显著低于肝硬化组和慢性乙型肝炎组(P=0.003,0.035),与慢性重型肝炎组间的差异没有统计学意义(P=0.229)。HCC组HBeAg阳性的患者有32人,占41.0%,非肝癌组HBeAg阳性46例,占59.0%。非肝癌组的HBeAg的阳性率显著高于肝癌组(χ~2=5.026,P=0.025)。HBeAg的定量服从χ~2分布,在HCC、LC、CHB组间有显著差异(χ~2=12.481,P=0.002)。HBeAg定量和HBV DNA的对数值显著相关(P=0.000)。抗-HBe定量和HBV DNA的对数值显著相关(P=0.003)。4.HBV DNA定量阳性且HBV DNA>4×10~2copies/ml的78例HCC患者、58例LC患者、20例CHB患者和42例慢性重型肝炎患者基因型和亚型分析:在HCC患者中,B基因型40例,C基因型37例,B/C基因型1例;肝炎肝硬化患者基因型B有35例,基因型C有23例;慢性乙型肝炎B基因型11例,C基因型有8例,B/C基因型1例;42例慢性重型肝炎患者中,基因型B 26例,基因型C 12例,B/C型4例。四组其基因型的分布无显著差异(P>0.05)。HCC组基因型C所占的比例(47.4%)略高于肝硬化组(39.7%)、慢性乙型肝炎组(40%)和慢性重型肝炎组(28.6%)。B基因型的亚型分析,HCC患者Ba亚型40例;肝硬化组Ba亚型32例,3例分亚型失败;慢性乙型肝炎组Ba亚型10例,1例Bj亚型;慢性重型肝炎组Ba亚型26例。C基因型的亚型分析,HCC患者Ce亚型24例(占64.9%),Cs亚型10例(占27.0%),3例分亚型失败;肝硬化组Ce亚型18例(占78.3%),Cs亚型4例(占17.4%),1例分亚型失败;慢性乙型肝炎组Ce亚型5例(占62.5%),3例分亚型失败;慢性重型肝炎组Ce 6例(占50.0%),Cs 4例(占33.3%),失败2例(占16.7%)。四组间C基因型的亚型分布无显著差异(χ~2=10.548,P=0.103)。结论1.血清HBV DNA水平从高到低依次为LC、CSH、HCC,提示:①因HBV复制所致肝炎可伴随肝硬化;②CSH时因免疫反应致使病毒水平略低;③HCC最低可能是复制病毒在宿主肝细胞整合的结果。2.肝癌患者是否合并肝硬化与HBV复制水平无明显相关;合并肝硬化的肝癌患者年龄显著高于无肝硬化患者。3.HBeAg的丢失和HBV DNA的降低成正相关。4.重庆地区HBV基因型以B型为主,C型也占相当比例;HBV基因型与肝癌的发病无明显相关性;B/C混合感染在慢性重型肝炎中较为常见。5.重庆地区的B基因型绝大部分为Ba亚型。C基因型以Ce亚型为主,其次为Cs亚型。HBV基因亚型在相关肝病中无明显差异。