论文部分内容阅读
目的:构建原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64,表达并纯化重组MPT64;酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与金纳米棒生物传感器分析重组MPT64抗原诊断结核病的效果,为结核病血清学诊断提供实验依据与技术支持。方法:提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,PCR扩增mpt64基因,克隆至pMD18-T载体,菌落PCR与测序鉴定阳性克隆,亚克隆至pET-28a(+)表达载体,菌落PCR与限制性内切酶酶切鉴定阳性重组子。IPTG诱导重组蛋白表达,亲和层析纯化重组蛋白MPT64,western-blot分析MPT64的抗原性。Bradford法测定MPT64抗原浓度,ELISA评价重组蛋白诊断结核病的效果。采用种子生长法制备金纳米棒,经十一巯基十一烷酸(MUA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰,将MPT64连接至金纳米棒,制备金纳米棒生物传感器,评价其诊断结核病的效果。结果:自结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增出mpt64基因;经克隆和测序鉴定,扩增的mpt64基因序列与Gen Bank中H37Rv的mpt64基因序列99%同源;经PCR和双限制性内切酶酶切鉴定,获得了与预期大小一致的DNA片段,表明成功构建原核表达质粒pET-28a(+)-mpt64。IPTG诱导阳性重组菌表达约26kDa的重组MPT64,经western-blot分析其具有良好的抗原性。ELISA分析MPT64诊断结核病的敏感度为81.4%,特异性为94.9%,阳性预测值为94.1%,阴性预测值为83.6%,诊断效率为88.1%。制备的金纳米棒经化学修饰后,成功构建基于MPT64抗原的金纳米棒生物传感器,其诊断结核病的敏感度为91.5%,特异性为93.2%,阳性预测值为93.1%,阴性预测值为91.7%,诊断效率为92.4%。对重组MPT64抗原的ELISA和金纳米棒生物传感器法检测结核病的效果,进行配对的四格表卡方检验χ2分析,P=0.146>0.05,差异无统计学意义。结论:(1)成功克隆和表达重组蛋白MPT64。(2)纯化的重组MPT64具有良好的抗原性。(3)重组MPT64的金纳米棒生物传感器诊断结核病具有较高的灵敏度与特异性。