植物遭受多种非生物逆境刺激信号时,细胞质中的钙离子的浓度会发生明显的变化,形成“钙信号”。逆境信号的下游传递是通过细胞内钙离子与相应钙结合蛋白的结合来进行的。目前为止,已报道的钙离子结合蛋白主要包括钙调素、CDPK、CBL等多种类型蛋白。CBL,是近年来报道比较多的植物中独有存在的一类钙离子结合蛋白。CBL是通过与其下游的基因家族CIPK蛋白激酶家族相结合并发挥作用的。CIPK是一类植物中存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族。CBL-CIPK信号网络系统在拟南芥植物中的研究较为详细及透彻,然而在木本植物胡杨中的研究却较为鲜少。毛果杨基因组序列的测序完成为进一步研究胡杨中CBL-CIPK逆境网络系统提供了重要的依据和参考。本实验室首次系统开展了胡杨CBL、CIPK全基因家族成员的克隆与功能研究,并取得了一定的前期积累,本研究重点深入研究胡杨CBL家族10个成员中的PeCBL6和PeCBL10基因。首先,使用CTAB法提取胡杨总RNA,并反转录成cDNA,同时根据毛果杨基因组序列和拟南芥基因组序列设计目的基因特异引物,以胡杨cDNA为模板成功克隆到了PeCBL6和PeCBL10基因。进一步分析了目的基因的组织表达特异性,结果表明胡杨PeCBL6和PeCBL10基因主要表达在植株的根部,而且基因瞬时表达量受低温、盐、旱逆境的诱导,不受ABA的诱导。其次,对目的基因PeCBL6和PeCBL10的亚细胞定位情况做了进一步的研究。将目的基因PeCBL6和PeCBL10构建于植物表达载体pBI121-GFP上,并采用花序侵染法对野生型拟南芥进行农杆菌转化,成功得到了转基因拟南芥。同时将不带有目的基因的空载体也转化了野生型拟南芥并得到了转基因植株,作为亚细胞定位分析实验的阳性对照。将野生型拟南芥植株(Col-0)、35S-PeCBL6转基因拟南芥植株、35S-PeCBL10转基因拟南芥植株和35S-GFP转基因拟南芥植株种子经过消毒后播种于固体MS培养基上,采用刚刚萌发并生根的植株根尖在激光扫描共聚焦显微镜下观察,结果发现PeCBL6基因的表达产物定位于细胞核上,PeCBL10基因的表达产物定位于细胞的液泡膜。虽然PeCBL6和PeCBL10均同源于拟南芥CBL10,但是它们的亚细胞定位情况存在差异,进一步说明了胡杨CBL家族成员的丰富性。在拟南芥中,CBL10基因与下游基因CIPK24存在相互作用,这一信号途径共同介导了拟南芥植株在盐胁迫下的抗逆性反应。本文中PeCBL6和PeCBL10均同源于AtCBL10,那么他们是否也与下游家族基因有相互作用呢?因此,将目的基因PeCBL6和PeCBL10构建于pGBKT7载体上,PeCIPKs家族成员构建于pGAD载体上,进行了酵母双杂交实验。结果表明：PeCBL6和PeCBL10不公与PeCIPK24、25(同源于AtCIPK23)有相互作用,而且还与PeCIPK10有相互作用,进一步丰富了植物CBL-CIPK信号网络系统,表明胡杨与拟南芥在抗逆机制方而存在一定差异。最后,通过转基因手段验证了胡杨PeCBL6和PeCBL10基因在模式植物拟南芥和三倍体毛白杨中的功能。首先是将目的基因采用花序侵染法对野生型拟南芥和突变体植株进行了转化,分别得到了回补植株和过表达植株。并在幼苗阶段和成苗阶段研究了不同株系的抗逆性。结果表明35S-PeCBL6转基因植株较野生型和突变体植株有较强的抗盐性和抗冷性；35S-PeCBL10转基因植株相比于野生型和突变体植株有较强的抗盐性和抗旱性。鉴于目的基因在模式植物拟南芥中的优良功能,本研究将目的基因PeCBL6和PeCBL10采用叶盘转化法对野生型三倍体毛白杨进行了农杆菌介导转化,并通过CPR、PCR、Southern Blot等检测方法做了转基因植株的鉴定,初步证明了目的基因已经成功整合到三倍体毛白杨基因组中。接下来便从组织培养苗和温室苗两个阶段来研究其抗逆性。从生根情况、枯叶片个数、叶绿素含量、丙二醛含量、相对电导率等生理指标进行了多方而综合评估,发现PeCBL6过表达转基因三倍体毛白杨植株比野生型三倍体毛白杨植株在盐胁迫和冷胁迫下有较强的抗性；PeCBL10过表达转基因三倍体毛白杨植株比野生型三倍体毛白杨植株在盐胁迫和旱胁迫下有较强的抗性。总之,本文通过对模式植物拟南芥和三倍体毛白杨的转基因研究,为利用胡杨PeCBL6和PeCBL10基因改良植物抗逆性及进一步探讨研究胡杨CBL-CIPK信号网络调控植物抗逆分子机理奠定了基础。本文中的甘露糖阳性筛选体系的成功使用,进一步验证了这一筛选标记基基因的使用广泛性,为以后研究其他木本值物的遗传转化奠定了基础和借鉴作用。同时本文中将胡杨PeCBL6和PeCBL10基因成功转化了三倍体毛白杨,为进一步在林木中研究林木自身优良基因功能奠定了一定的基础。