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本论文旨在研究Myostatin(MSTN)在肌肉组织内的几种多潜能干细胞(多潜能间充质干细胞、肌卫星细胞、脂肪间充质干细胞)向脂肪细胞方向分化中及MSTN在脂肪沉积中的功能,探讨MSTN对肌内脂肪细胞形成和猪脂肪沉积的作用。首先以C3H10T1/2细胞为多潜能间充质干细胞模型,用人的重组MSTN蛋白处理不同分化状态下的C3H10T1/2细胞,然后再用标准的脂肪诱导培养基处理细胞诱导其形成脂肪细胞。在此基础上分析MSTN蛋白对脂肪形成的作用,及此过程中所作用的受体及信号传导途径中的相关蛋白磷酸化情况。并分析了MSTN在C3H10T1/2细胞中对成肌分化能力的影响。同时原代分离了猪的肌卫星细胞和脂肪间充质干细胞,分析了MSTN在这两种肌肉中的成体干细胞定型分化为脂肪细胞中的作用。克隆了猪的MSTN基因启动子片段,将其克隆至pGL3-Basic报告载体中,分析了脂肪分化过程中相关的因子对MSTN基因启动子转录活性的影响,为猪的MSTN基因的表达调控提供了实验依据。分析了MSTN和它的受体在背肌、背部脂肪和腹部脂肪组织中生长过程中的表达模式,为猪脂肪组织在生长过程受MSTN的调控提供了一定的依据。通过系统研究得出如下结果：1. MSTN对C3H10T1/2细胞的成脂影响结果表明：当在C3H10T1/2细胞成脂诱导过程中添加MSTN时,成脂分化影响不太明显,但在该过程中若同时添加PPARγ激活剂,则50 ng/ml MSTN能明显的增强脂肪分化作用。当用MSTN处理C3H10T1/2细胞后再经成脂诱导,低浓度的MSTN(5 ng/ml)即能显著的增强脂肪分化作用。5’-氮胞苷能开启C3H10T1/2细胞的成肌分化和成脂分化能力。当用5’-氮胞苷处理C3H10T1/2细胞的过程中添加MSTN在50 ng/ml时,能显著的增加脂肪分化。但5’-氮胞苷处理C3H10T1/2细胞后再用MSTN和脂肪诱导培养基处理细胞则脂肪分化能力未见明显增强。这提示MSTN在诱导C3H10T1/2细胞分化为脂肪细胞过程为在分化早期抑制该细胞的成肌分化能力而促进它的成脂分化能力。在调控过程中MSTN可能通过先结合到ActRⅡB上,然后主要通过与ALK4结合进而对下游基因起调控作用,ALK5可能起一定的辅助作用。对其作用的信号通路分析发现,MSTN可磷酸化Smad2/3及p38-MAPK。在MSTN对该细胞的成肌分化过程中的作用分析发现,MSTN可以通过对Smad2和p38-MAPK信号途径对成肌分化起抑制作用。2.MSTN对肌肉中成体干细胞成脂分化的影响用酶消化法分离了猪的肌卫星细胞和脂肪间充质干细胞。通过细胞免疫化学染色检测表明肌卫星细胞表达CD44和Desmin这两个蛋白,而脂肪间充质干细胞只表达CD44而不表达Desmin蛋白。当肌卫星细胞和脂肪间充质干细胞在成脂分化过程中,用不同浓度MSTN处理细胞时,随着MSTN处理浓度的增加,这两种细胞的脂肪分化效果都受到浓度依赖的抑制作用。用MSTN处理肌卫星细胞后再进行成脂诱导,发现随着MSTN浓度的增加,脂肪分化依然能受到抑制。但用MSTN处理脂肪间充质干细胞后再进行成脂诱导,发现随着MSTN浓度的增加,脂肪分化并未受到抑制。用50 ng/ml MSTN按上述处理细胞后提取RNA,然后通过实时定量PCR检测脂肪分化的两个标志基因PPARγ和aP2的表达也证实了上述结果。由此推测MSTN对肌卫星细胞和脂肪间充质干细胞的脂肪分化效果存在差异。由于MSTN是肌肉的分泌性蛋白,可直接作用于它周围的细胞,进一步推测肌内脂肪细胞的前体细胞可能主要来源于脂肪间充质干细胞。3.MSTN基因启动子的转录活性研究根据NCBI数据库公布的MSTN基因全长序列,设计引物扩增获得了猪的MSTN基因1709 bp启动子片断,将其通过5’截短技术构建至pGL3-Basic载体中,构建了6个不同长度大小的MSTN启动子载体。分析了这些载体在C2C12细胞和肌管中的转录活性,及这些片断在经DIM处理的C3H10T1/2细胞中的转录活性。将最长的片断与MyoD、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ表达质粒共转染后发现,MSTN的转录活性可被MyoD和PPARy上调(P<0.05),它的转录活性可被C/EBPα和C/EBPβ抑制(P<0.05)。将最长的片断转染C3H10T1/2细胞后,用DIM的各个组分处理该片断,发现MSTN启动子片断的转录活性可被IBMX和rosiglitazone上调(P<0.05),而不受Insulin和地塞米松影响(P>0.05)。结合这些结果,推测：在多潜能干细胞的脂肪诱导过程中,MSTN可被IBMX短暂的诱导发挥某种生物功能,当C/EBPα和C/EBPβ表达以后MSTN的表达受到抑制。4.MSTN在猪脂肪沉积中的表达模式研究提取了35日龄、2月龄、3月龄、4月龄、6月龄梅山猪背肌、腹部脂肪和背部脂肪组织的RNA,将它们反转录成cDNA。用荧光定量PCR方法检测了不同组织不同时期的样品中的MSTN、ActRIIb、PPARy和ap2的相对表达,分析了MSTN与脂肪组织生长的关系。结果表明MSTN基因与它的受体在背肌中从35日龄到6月龄呈先降低后增加的趋势。在背肌中MSTN与aP2和PPARy成弱的正相关(r<0.3),但未达到显著水平。推测：MSTN从35日龄到3月龄的表达逐渐降低可能与肌肉在该时期的生长有关,3月龄以后MSTN与它的受体表达增加,可能与该时期肌肉生长减缓有关。MSTN的表达在背部脂肪除2、4月龄外表达呈上升的趋势,ACVR2B的表达除2月龄外也显示上升的趋势,aP2的表达也呈一个上升的表达趋势。而对MSTN与aP2和PPARy进行相关性分析发现,它们成正相关(P<0.05)。因此推测MSTN和ACVR2B在背脂中的表达模式可能反映了它们对肥胖的应对。腹部脂肪中MSTN和它的受体在腹部脂肪的在所有的时间点中35日龄表达最高。MSTN与aP2和PPARy成负相关(P<0.05)。推测在腹部脂肪组织中MSTN在除35日龄外其它时期的低表达与该脂肪组织的脂肪细胞在这些时期的更好的生长有关。