【摘 要】
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目的:柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）可导致多种人类疾病,如手足口病、心肌炎、无菌性脑膜炎等。在肠道病毒导致的病毒性心肌炎中CVB3是最常检出的病原体,部分患者可发展为慢性心肌炎、扩张性心肌病和心力衰竭,是青少年及运动员心源性猝死以及心力衰竭患者心脏移植的主要病因之一,对人类健康造成严重威胁。但是针对CVB3目前仍无有效的治疗和预防手段。最近多个研究发现,胰岛素样
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目的:柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）可导致多种人类疾病,如手足口病、心肌炎、无菌性脑膜炎等。在肠道病毒导致的病毒性心肌炎中CVB3是最常检出的病原体,部分患者可发展为慢性心肌炎、扩张性心肌病和心力衰竭,是青少年及运动员心源性猝死以及心力衰竭患者心脏移植的主要病因之一,对人类健康造成严重威胁。但是针对CVB3目前仍无有效的治疗和预防手段。最近多个研究发现,胰岛素样生长因子2-m RNA结合蛋2（insulin-like growth factor 2 m RNA-binding proteins 2,IGF2BP2）参与多种病毒的感染过程,在病毒生命周期的早期阶段对病毒复制起到抑制作用。但是目前对于IGF2BP2在CVB3的复制中的调控作用及机制,尚缺乏研究。因此,本研究利用基因敲低和过表达等手段,初步探讨了IGF2BP2对CVB3复制的影响,并初步验证了IFN刺激基因20（20k-Da IFN-stimulated gene,ISG20）作为其下游基因对病毒复制发挥作用,为进一步揭示病毒致病机制,筛选新的抗病毒治疗靶点提供参考依据。方法:1.利用本室保存的CVB3感染性克隆p MKS1-CVB3-e GFP转染Hela细胞,用转染后的上清液感染Hela细胞,当细胞出现明显病变后收获上清,继续感染Hela细胞,共重复三次。从而成功的拯救出了带有e GFP标记的CVB3病毒并对病毒滴度进行滴定。2.1,000TCID50的CVB3-e GFP感染Hela细胞,在CVB3-e GFP感染后不同时间点（24、36、48h）收集细胞,通过Western blot检测IGF2BP2的表达,以明确感染时间对IGF2BP2表达的影响。3.将慢病毒包装质粒系统ps PAX2和p MD2.G与lenti CRISPRv2-IGF2BP2质粒共转染293T细胞,并使用lenti CRISPRv2-NC质粒作为阴性对照分别于48、72h收取培养上清液,此时上清液中含有包装好的慢病毒;用转染后的上清液感染Hela细胞,并在细胞培养基中加嘌呤霉素筛选,稳定传代三次,用q RT-PCR和Western blot检测Hela细胞IGF2BP2的敲低效果,从而完成稳定敲低IGF2BP2的Hela细胞系的建立。4.稳定敲低IGF2BP2基因的Hela细胞系与过表达质粒pc DNA3.1（+）-IGF2BP2转染的Hela细胞,分别感染CVB3-e GFP,24、48h后收取细胞,提取总RNA和总蛋白,通过q RT-PCR及Western blot检测CVB3 RNA和蛋白的表达;并通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光强度判断病毒的复制,以明确IGF2BP2对CVB3复制的影响。5.分别提取Hela细胞和pc DNA3.1（+）-IGF2BP2质粒转染Hela细胞蛋白,通过RNA免疫共沉淀实验拉取与IGF2BP2蛋白相互作用的RNA,再通过q PCR检测相应基因,从而进一步探究IGF2BP2对CVB3-e GFP复制调控的具体机制。6.稳定敲低IGF2BP2基因的Hela细胞系与阴性对照细胞系,和过表达质粒pc DNA3.1（+）-IGF2BP2转染48h后的Hela细胞,分别提取细胞总RNA和总蛋白,通过q RT-PCR和Western blot检测细胞ISG20的表达。7.构建过表达质粒pc DNA3.1（+）-ISG20转染IGF2BP2敲低Hela细胞24h后,以及IGF2BP2敲低Hela细胞和对照细胞感染CVB3-e GFP细胞24h后,提取总RNA和总蛋白,通过q RT-PCR和Western blot检测CVB3 RNA和蛋白的表达及细胞IGF2BP2的表达。结果:1.CVB3-e GFP重组病毒被成功拯救,并能够感染Hela细胞,建立了一种可靠的CVB3染细胞模型,用于抗病毒疫苗和药物研究2.CVB3-e GFP感染可诱导细胞内IGF2BP2的表达下调。3.IGF2BP2作为一种抗病毒因子在CVB3-e GFP感染过程中发挥作用。稳定敲低Hela细胞中的IGF2BP2可以促进CVB3的复制,过表达IGF2BP2可抑制其复制。4.RNA免疫共沉淀实验证明,在CVB3-e GFP感染细胞中IGF2BP2与ISG20 m RNA之间存在相互作用。5.IGF2BP2敲低Hela细胞过表达ISG20,可以抑制IGF2BP2敲低细胞中的CVB3-e GFP复制。结论:1.CVB3-e GFP重组病毒被成功拯救,CVB3-e GFP感染Hela细胞模型成功建立。2.敲低和过表达结果均证明IGF2BP2作为一种抗病毒基因在CVB3感染过程中发挥作用。3.在CVB3感染中IGF2BP2与ISG20 m RNA之间存在相互作用。ISG20作为IGF2BP2的下游基因,抑制CVB3的复制。
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