褐藻胶酶解寡糖的制备、分离和结构鉴定

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目的:本论文利用菌株Vibrio 510产生的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶,探讨酶解得到褐藻胶寡糖的生产工艺,及分离纯化褐藻胶寡糖以得到相应标准品从而丰富海洋寡糖库,以此为基本目的和出发点,并且为探讨该褐藻胶裂解酶酶解行为、酶解位点,做先期的工作。方法:应用紫外法与DNS法对该褐藻胶裂合酶的酶活进行测定。应用紫外扫描法、凝胶渗透色谱技术(HPGPC——TSK G2500PWXL)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对不同时间酶解产物组分的分子量及相对含量加以分析。对酶解寡糖进行分离纯化:应用凝胶过滤色谱法(Bio-Gel P-4;P-6)、阴离子交换色谱法(Q-Sepharose.Fast Flow),其间应用新技术——快速液相色谱仪(FPLC)对分离条件进行优化和确定。对所得寡糖应用灌注色谱技术(HQ-20)检测其纯度,并应用此方法进一步纯化;同时运用荧光辅助糖电泳(FACE)和高效毛细管电泳(HPCE)技术作为进一步检测纯度的方法。应用ESI-MS、NMR等对得到的寡糖进行结构鉴定。结果:本文应用紫外法和DNS法对该酶的酶活进行检测,从海藻中筛选出的菌株Vibrio 510所产褐藻胶裂解酶有较高的比活力:22.5unit/mL。HPGPC和PAGE方法对褐藻胶的降解程度有良好的检测效果,快捷、高分辨率和直观是这两种方法的共同点。凝胶渗透色谱与阴离子交换色谱均对褐藻胶寡糖有良好的分离效果,得到四个组分。经灌注层析进一步纯化,应用FACE和HPCE检测二糖为一结构单一的化合物,三糖到五糖均有异构体的存在。应用ESI-MS确证四个组分分别为二糖到五糖,且聚合度单一。同时对结构单一的二糖利用1H-NMR,13C-NMR,1H-13C HMQC和1H-1H COSY进行了结构的确定——非还原端存在双键的古罗糖醛酸二糖。讨论:一方面,通过进一步的分离纯化得到单一结构的化合物,在对单体结构进行分析确定的同时,所得结果将会为酶解行为特点的确定提供必要的信息,以便于对酶解工艺作进一步的指导;另一方面得到较高聚合度的寡糖,并进行活性的筛选。
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