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前言宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤,占女性生殖系统恶性肿瘤的半数以上,严重威胁女性的健康。我国宫颈癌的发病率逐年上升,且呈年轻化趋势。人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus,HPV)感染是其重要至病原因之一。鸦胆子油乳(Brucea javanica oil emulsion,BJOE)为苦木科植物鸦胆子Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果实的提取物,能够穿透血脑屏障,降低颅内压。同时还可以用于治疗HPV引起的多种疣。研究表明,鸦胆子油乳的主要活性成分--油酸和亚油酸具有很强的抗癌活性。该药与放疗和/或化疗联合应用有一定的防止白细胞和血小板降低的作用,还可促进骨髓干细胞形成,调节免疫力,从而提高患者的生存质量。临床上已被应用于肺癌、肝癌、转移性脑瘤等多种恶性肿瘤的辅助治疗。但是目前尚未见用该药治疗宫颈癌的临床报道。本研究用鸦胆子油乳体外实验研究观察该药对SiHa细胞的抑制作用极其作用机制。研究结果可为鸦胆子油乳用于临床宫颈癌的辅助治疗提供实验基础和依据。方法一、细胞培养常规方法培养SiHa细胞。二、细胞抑制率的检测将SiHa细胞转移到96孔细胞培养板中,加入不同浓度药物,继续培养24h、48h和72h,每孔加入MTT和二甲基亚砜(DMSO),常规方法用酶标仪在550nm处测吸光度(OD值)。三、凋亡细胞形态学检测不同浓度鸦胆子油乳作用细胞48h后,分别收集所有细胞,常规方法制作电镜标本,透射电镜观察凋亡细胞形态。四、凋亡细胞DNA梯带的观察细胞经不同浓度鸦胆子油乳药物作用48h后,分别收集所有细胞,常规方法提取DNA,琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察拍照。五、细胞凋亡率的检测细胞加入鸦胆子油乳,继续孵育48h,收集不同药物浓度处理的SiHa细胞,流式细胞仪检测凋亡率。结果一、药物对细胞抑制率的检测结果不同浓度的鸦胆子油乳作用24h、48h、72h后,对宫颈癌细胞系SiHa细胞有很强的抑制作用。细胞抑制率与时间和药物浓度有关。随着作用时间的延长和药物浓度的加大,细胞毒性作用逐渐增强,存在时间和浓度依赖性。二、细胞形态学改变透射电镜观察凋亡细胞形态,对照组细胞绒毛清晰,细胞膜、核膜均完整;不同浓度药物作用48h后,可以看到早期细胞核内染色质凝聚,边集于核膜及晚期核内出现凋亡小体。三、琼脂糖凝胶电泳结果观察20μg/ml药物组琼脂糖凝胶电泳上显示明显的凋亡梯带,而对照组及10μg/ml药物作用组则没有出现片段化。四、细胞凋亡率的检测结果在不同浓度鸦胆子油乳作用48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。看到总体凋亡率逐渐生高,早期与晚期共同凋亡率与空白对照组比较差异具有显著性。讨论本文首次用鸦胆子油乳体外实验研究观察该药对宫颈癌SiHa细胞的抑制作用。结果表明,鸦胆子油乳在体外能够明显抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,随药物浓度的增加和作用时间的延长其抑制作用逐渐增强。细胞的凋亡与肿瘤的发生及其相关,诱导肿瘤细胞凋亡是很多化疗药物的作用机制之一。本研究表明经鸦胆子油乳作用48h后电子显微镜观察到凋亡小体。DNA梯带法检测到凋亡时DNA降解形成的梯带。从形态学和生物化学及分子生物学角度证实了鸦胆子油乳对SiHa细胞有诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测细胞凋亡率,看到总体凋亡率逐渐生高,早期与晚期共同凋亡率与空白对照组比较差异具有显著性。进一步说明鸦胆子油乳对SiHa细胞的抑制作用是通过诱导其凋亡实现的。结论1、鸦胆子油乳在体外能够明显抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,具有时间和浓度的依赖性。2、鸦胆子油乳抑制SiHa细胞增殖的作用机制是通过诱导细胞凋亡实现的。