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第一部分高氧BPD模型的建立以及hucMSC-sEVs的提取目的:建立高氧诱导的新生大鼠BPD模型,提取并鉴定hucMSC-sEVs。方法:将新生SD大鼠生后立即（P0）与母鼠一起放入高氧箱（Fi O2=85%）中持续高氧,每两天交换母鼠以减轻氧毒性作用。在P3、P7、P14、P21天收集新生大鼠左肺组织,脱水后石蜡包埋切片,进行HE染色,观察新生大鼠肺泡结构,利用Image Pro Plus软件统计平均肺泡线性截距（MLI）量化肺泡内径大小。第4-6代的人脐带间充质干细胞（hucMSCs）长满60-70%后,换无小细胞外囊泡（sEVs）的培养基培养48h,收集细胞上清,利用超速离心法提取hucMSC-sEVs,通过透射电镜（TEM）检测hucMSC-sEVs的形态和大小,Western blot技术检测外泌体表面标志物Alix和CD63,粒径跟踪分析仪（NTA）检测hucMSC-sEVs粒径大小分布范围。结果:1.高氧组新生大鼠MLI在P7（65.30±2.77 vs.55.70±1.40μm,P（27）0.05）、P14（82.74±3.70 vs.58.64±1.96μm,P（27）0.01）、P21（92.08±2.52vs.59.28±1.84μm,P（27）0.001）与空气组相比明显增大,表现为肺泡简化,次级脊不典型甚至消失;2.hucMSC-sEVs在TEM下呈双凹圆盘状,直径约30-150nm,囊内可见低密度透亮区;hucMSC-sEVs阳性表达外泌体表面标志物Alix和CD63;NTA显示颗粒多集中在70-300nm,峰值为175nm。结论:新生大鼠高氧14天可出现BPD的病理表现（肺泡结构简单化）;使用超速离心法能提取出以外泌体为主的hucMSC-sEVs。第二部分hucMSC-sEVs治疗高氧BPD模型的有效性研究目的:观察人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（hucMSC-sEVs）对高氧新生大鼠BPD模型的治疗作用。方法:将新生的SD大鼠生后立即（P0）随机分为3组:（1）空气对照组（RA+PBS）:新生大鼠在空气条件下饲养,P7气管给予PBS;（2）BPD模型组（BPD+PBS）:新生大鼠P0至P14暴露于85%的高氧环境下,P7气管给予PBS;（3）hucMSC-sEVs治疗组（BPD+hucMSC-sEVs）:新生大鼠P0至P14暴露于85%的高氧环境下,P7气管给予hucMSC-sEVs,分别在注射后0、2、12、24、72h处死并收集标本。我们利用PKH26标记示踪hucMSC-sEVs在BPD新生大鼠肺内的迁移。另外,我们在P14处死并收集标本,通过观察各组新生大鼠肺组织病理结构、体重增长情况、肺动脉高压相关指标（富尔顿指数和右心体重比）、肺功能（LR和Cydn）和支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数、总蛋白浓度、IL-6以及IL-10水平来评估hucMSC-sEVs对BPD新生大鼠的治疗作用。结果:1.免疫荧光示踪显示,通过气管给予hucMSC-sEVs,hucMSC-sEVs开始主要集中在大气道,2h逐渐在损伤的肺部均匀分布,12h左右达到高峰,并持续至72h;2.BPD模型组新生大鼠MLI在P14时与空气对照组相比明显增大（98.93±7.27 vs.61.34±3.99 mm,P<0.001）,表现为肺泡内径增大,肺泡简化,hucMSC-sEVs治疗后MLI降低（67.26±5.32 mm,P<0.01 vs.BPD）;3.BPD模型组P14体重增长率较空气对照组明显降低（1.69±0.09 vs.2.77±0.05,P<0.001）,hucMSC-sEVs治疗后体重增长率有所改善（2.09±0.11,P<0.05 vs.BPD）;4.BPD模型组P14的富尔顿指数和右心体重比较空气对照组均明显增高（0.38±0.02 vs.0.28±0.01,P<0.001;1.17±0.06 vs.0.83±0.03,P<0.001）,hucMSC-sEVs干预后富尔顿指数和右心体重比下降（0.27±0.16,,P<0.001 vs.BPD;0.89±0.03,P<0.05 vs.BPD）;5.BPD模型组新生大鼠P14的LR较空气对照组明显增高（1.23±0.05 vs.0.49±0.04,P<0.001）,Cydn明显降低（0.02±0.002 vs.0.05±0.004,P<0.001）,给予hucMSC-sEVs干预后可逆转LR（0.65±0.03,P<0.001 vs.BPD）和Cydn（0.03±0.002,P<0.05 vs.BPD）的改变;6.BPD模型组P14新生大鼠BALF中细胞总数（101.70±11.09 vs.34.92±2.06,P<0.001）、总蛋白浓度（8.54±0.86 vs.2.09±0.22,P<0.001）、和IL-6水平（49.59±6.85 vs.20.19±1.82,P<0.01）较空气对照组均明显升高,IL-10水平明显降低（267.90±4.36 vs.326.30±5.95,P<0.001）,hucMSC-sEVs干预后能降低BALF中细胞总数（72.04±5.57,P<0.05 vs.BPD）、总蛋白浓度（5.35±0.64,P<0.05 vs.BPD）和IL-6水平（29.75±2.53,P<0.05 vs.BPD）,促进IL-10的分泌（292.6±6.11,P<0.05 vs.BPD）。结论:hucMSC-sEVs气管注射2h后可在肺内均匀分布,12h达摄取高峰,其在肺内停留时间可持续至72h;hucMSC-sEVs能改善新生大鼠高氧BPD模型的肺泡简化,提高新生大鼠的体重增长率,减轻肺动脉高压,改善肺功能损害;hucMSC-sEVs能减轻新生大鼠高氧BPD模型BALF中的炎症指标。第三部分hucMSC-sEVs治疗高氧BPD模型有效性的机制探讨目的:探讨huc MCS-sEVs治疗新生大鼠高氧BPD模型主要影响的细胞类型,推测hucMSC-sEVs治疗BPD的分子机制及发挥治疗作用的关键成分。方法:对不同处理组的新生大鼠P14的肺组织进行冰冻切片,通过组织免疫荧光检测肺组织切片中Ki-67、TUNEL和SPC阳性的细胞数和CD31阳性的微血管（（27）100μm）数目。免疫细胞荧光观察PKH26标记的hucMSC-sEVs与人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）或小鼠II型肺上皮细胞株（MLE-12）共培养0,2,12和24h的摄取情况。体外实验分为三组:正常培养组（RA）、高氧处理组（HYP）、hucMSC-sEVs处理组（HYP+s EV）。将HUVEC细胞在不同条件下培养24h,然后接种到Matrigel基质胶上,5h后光学显微镜下观察HUVEC血管生成的情况。通过CCK-8和Ki-67细胞免疫荧光检测不同处理组MLE-12细胞增殖的情况,Annexin V流式分析和TUNEL细胞免疫荧光检测不同处理组MLE-12细胞凋亡的情况。利用Western blot技术检测不同处理组新生大鼠肺组织匀浆中PTEN、p-Akt/Akt、caspase3和VEGF-A的表达情况。对hucMSC-sEVs中的mi RNA进行测序,并对TOP50的mi RNA靶基因进行GO和KEGG通路富集分析。结果:1.BPD模型组肺组织中Ki67阳性的细胞数较空气对照组明显减少（10.92±0.46 vs.22.20±3.27,P<0.01）,TUNEL阳性的细胞数明显增加（2.91±0.34 vs.0.19±0.06,P<0.001）,给予hucMSC-sEVs后Ki67阳性细胞数明显升高（19.67±1.24,P<0.05 vs.BPD）,TUNEL阳性细胞数明显降低（1.31±0.25,P<0.05 vs.BPD）;2.与空气对照组相比,BPD模型组CD31阳性的微血管数（<100μm）（4.20±0.27 vs.12.23±0.81,P<0.001）和SPC阳性的细胞数明显减少（14.38±1.24 vs.29.25±0.61,P<0.001）,给予hucMSC-sEVs治疗后CD31阳性的微血管数（6.39±0.32,P<0.05 vs.BPD）和SPC阳性细胞数明显增加（23.03±1.50,P<0.05 vs.BPD）;3.PKH26标记的hucMSC-sEVs与HUVEC或MLE-12细胞共同培养,2h后开始被细胞摄取,12h主要位于细胞质,24h时有少部分hucMSC-sEVs聚集在核膜上;4.高氧组HUVEC生成的血管长度较空气对照组明显减少（8.07±0.27 vs.13.00±0.44 mm,P<0.01）,hucMSC-sEVs干预后生成血管总长度显著增加（11.04±1.05 mm,P<0.05vs.HYP）;5.hucMSC-sEVs干预能明显减少高氧环境下TUNEL阳性的MLE-12细胞数（0.44±0.06 vs.2.21±0.34,P<0.01）,还能明显抑制高氧环境下MLE-12细胞的凋亡比率（8.93%±1.05%vs.12.12%±0.32%,P<0.05）;6.hucMSC-sEVs干预后能明显抑制BPD组PTEN（1.03±0.14vs.1.80±0.20,P<0.05）和caspase3（0.69±0.04 vs.1.08±0.11,P<0.01）的表达水平,提高BPD组p Akt（0.49±0.03 vs.0.33±0.04,P<0.05）和VEGFA（0.48±0.05 vs.0.20±0.03,P<0.05）的表达水平;7.hucMSC-sEVs中表达量最高的mi RNA为mi R-21-5p;TOP50高表达mi RNA的靶基因GO富集性分析显示hucMSC-sEVs中高表达的mi RNA与调节增殖、凋亡、血管生成和肺发育显著相关;KEGG富集分析与PI3K-Akt,VEGF和Ras通路显著相关。结论:hucMSC-sEVs对新生大鼠高氧BPD模型的TIIAECs和PVECs均具有保护作用;hucMSC-sEVs能改善高氧环境下MLE-12细胞的存活,促进高氧环境下HUVECs的血管生成;hucMSC-sEVs促进肺泡化和血管生成的机制可能与PTEN/Akt的激活有关;hucMSC-sEVs中表达量最高的mi RNA为mi R-21-5p;hucMSC-sEVs中高表达的mi RNA能参与调节增殖、凋亡、血管生成和肺发育;与PI3K-Akt,VEGF和Ras通路相关。