论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显著的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显著抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。