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研究背景:胆囊癌（gallbladder carcinoma,GBC）是消化系统中发病率第5位,病死率较高的恶性肿瘤。近年来我国胆囊癌发病率呈上升趋势,每年新发病例数约5万例。临床上对于胆囊癌的治疗首选根治性手术切除,但由于该病早期无特异临床表现,发现较晚,发现时常伴局部及远端转移,随后病情发展迅速,预后极差,因此针对胆囊癌的放、化疗,分子靶向治疗等综合治疗逐渐成为胆囊癌的主要治疗手段。随着化疗药物在实体肿瘤中的广泛应用,其在晚期胆囊癌治疗中起了一定作用。目前胆囊癌的化疗方案以吉西他滨+铂类联合化疗为主,尽管化疗可增加肿瘤的可切除性和生存率,然而中位生存期仍不足15个月,因此,寻找新的治疗手段对胆囊癌的防治有重要的临床意义。近年来,分子靶向治疗利用特异性阻断剂干扰肿瘤细胞表达的某种信号分子,抑制肿瘤生长和侵袭,从而达到肿瘤治疗效果,如用于治疗胃癌的阿帕替尼、治疗甲状腺癌的仑伐替尼在临床实验中都取得了很好的疗效。目前已知与胆囊癌相关的靶点有血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）家族等,针对这些靶点已有吉非替尼,厄洛替尼,贝伐珠单抗等靶向药物进入临床研究,但治疗效果仍不理想。吡咯替尼（Pyrotinib）是在我国新批准上市用于治疗ErbB2/HER2阳性乳腺癌的靶向化疗药物,该药通过结合并抑制人表皮生长因子受体2（ErbB2/HER2）的靶点,进一步引起下游信号通路的改变抑制肿瘤细胞生长,目前该药物在胆囊癌中的应用国内、外尚无研究报道。随着第二代基因测序技术发展,大量研究报道了胆囊癌组织存在ErbB2基因的异常表达,在此基础上,有实验研究对胆囊癌NOZ和SGC-996等细胞系进行该基因沉默表达,结果发现肿瘤细胞的生长受到抑制,这些数据显示了ErbB2的致癌潜力,在细胞实验水平靶向减少该基因的表达,可初步抑制肿瘤细胞的生长,因此本研究拟探究吡咯替尼对胆囊癌细胞系的杀伤作用,并为进一步研究其可能作用机制。目的:探究吡咯替尼对胆囊癌NOZ、SGC-996细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭作用的影响。方法:CCK-8实验测量用不同浓度吡咯替尼处理胆囊癌NOZ、SGC-996细胞系24小时、48小时和72小时后的吸光度值变化,计算抑制率和半数抑制浓度(IC50),随后选择48小时计算所得的抑制率在25%,50%,75%所对应的药物浓度作为后续细胞实验的给药浓度处理细胞。细胞克隆形成实验探究吡咯替尼对胆囊癌细胞增殖的影响。Transwell实验用于观察迁移和侵袭改变。流式分析凋亡细胞比率,以及western blot分析凋亡相关蛋白表达。结果:1.吡咯替尼抑制胆囊癌细胞增殖:用CCK-8实验检测吡咯替尼对NOZ、SGC-996细胞活力的影响。用吡咯替尼处理后的NOZ、SGC-996细胞的活力随处理浓度增加,细胞活力逐渐下降,同时随着吡咯替尼作用时间延长,细胞活力呈明显下降趋势。在加药后48小时,细胞抑制率随加药浓度升高从20%升高到70%;对于NOZ和SGC-996细胞在24h、48h和72h的IC50分别是:11.5μmol/L,3.6μmol/L,1.4μmol/L和5.5μmol/L,5.2μmol/L,2.4μmol/L。差异具有统计学意义（P<0.05）。2.吡咯替尼对胆囊癌细胞克隆形成能力的影响以及对细胞增殖转移的影响:进行克隆形成实验以测定单细胞增殖能力。吡咯替尼处理后引起胆囊癌细胞集落形成能力呈现剂量依赖性降低,此外,处理组中形成的集落数量和大小均明显小于对照组。上述结果证明了吡咯替尼可抑制胆囊癌细胞的活力和增殖能力（P<0.05）。3.吡咯替尼对胆囊癌细胞侵袭和迁移能力的抑制作用:Transwell小室实验分析表明,与对照组相比,用吡咯替尼处理12小时后,穿过带基质胶和不带基质胶的Transwell小室膜的细胞数随处理浓度增加减少。以上结果证明吡咯替尼抑制胆囊癌NOZ、SGC-996细胞的侵袭和迁移能力（P<0.05）。4.吡咯替尼诱导胆囊癌细胞发生凋亡:为探讨吡咯替尼对胆囊癌细胞凋亡的影响,用前述浓度处理胆囊癌NOZ、SGC-996细胞48小时后,使用流式细胞仪分析了细胞凋亡率。在双参数散点图中,LL象限代表活细胞,LR和UR象限分别代表早期凋亡和晚期凋亡细胞。随着吡咯替尼处理浓度的增加,存活的细胞百分比减少,而早期凋亡和晚期凋亡的细胞数均增加,这些数据均表明吡咯替尼诱导胆囊癌细胞发生凋亡。为了进一步研究吡咯替尼诱导细胞凋亡的机制,我们通过Western blot检测了caspase家族,Bcl-2家族和其他在凋亡过程中期起关键作用的重要蛋白表达结果表明,吡咯替尼增加了Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP和Bax的表达,同时降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。此外,Bcl-2与Bax的比例呈剂量依赖性降低趋势（P<0.05）。结论:吡咯替尼在体外能够抑制胆囊癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭,通过促进凋亡发挥了细胞杀伤作用,为胆囊癌的分子靶向药物临床治疗提供了新的选择。