结核病(tuberculosis, TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的以肺部慢性肉芽肿炎症病变为主的慢性传染病。结核菌经呼吸道传播,其自然感染率非常高,虽仅有5%的自然感染人群会产生活动性肺结核及后续缓慢发作的肺结核干酪杨坏死和空洞型肺结核,95%的感染人群处于潜伏感染状态,在免疫力下降或空气环境因素等变化,很容易进展为活动性肺结核,同时人群传播极快。肺结核是十九-二十世纪间发病广泛、传染迅速、病程漫长、严重损伤健康与劳动力的感染性疾病。1919年前后,法国细菌学家Calmette和Guerin受牛痘疫苗的启发,将牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)在培养基传代230次,获得一株毒力显著减弱的减毒牛型结核杆菌------卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)是用于预防结核病的疫苗,经人体免疫试验,发现具有良好的预防肺结核功能。卡介苗的发明和全球接种使肺结核不再成为老百姓闻之色变的严重传染病。随后多种抗菌素的发现、利福平、异烟肼等化学抗菌药物的出现,使肺结核的治疗非常有效。然而上世纪80年代起,由于多重耐药结核菌株的出现导致一线抗结核化学药物失效、及卡介苗在控制肺结核疗效的不稳定甚至失效,人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核菌感染等问题的出现,肺结核重新成为再现(re-emerging)的严重传染病,并位居世界三大传染病之一。世界卫生组织(WHO)((2014年全球结核病报告》显示,2013年全球900万人新染结核病,其中印度和中国分占24%和11%(100万),150万人死亡,其中36万为艾滋病患者。虽然从1990～2013年间肺结核的患病率与死亡率已显著降低了41%和45%,但其发病总数提示肺结核仍未有效控制。由于卡介苗仅能预防儿童原发性结核和肺外结核,对于耐药及多耐药结核菌的控制仍无好的方法,全球人口流动持续增高,因此防控结核病的重心仍旧应当定位于预防性结核疫苗的改良、创新研制和全球接种。研制新型结核疫苗具有重要的意义。结核疫苗研制的最重要基础和最大障碍在于迄今对于天然抗结核免疫保护机制和疫苗抗结核免疫保护评价指标仍有不解和争议。与目前大多数成功抗感染疫苗的保护机制(如乙肝预防性疫苗)所显著不同的是,抗结核免疫保护的中心法则是主要依赖T细胞免疫而不是抗体。在T细胞免疫中,最初认为是分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞,通过激活肺泡巨噬细胞吞噬小体成熟酸化及与溶酶体融合、自噬小体形成与有效降解、iNOS杀菌系统等机制充分杀灭结核分枝杆菌。然而关于IFN-γ的抗结核免疫保护功能近年产生很多争议,全血IFN-γ水平甚至是潜伏结核进展为活动性结核的危险因素；BCG人群免疫后评估发现外周血IFN-γ+Th细胞频率与免疫保护/肺结核进展没有相关性；IFN-γ还具有活化Treg和限制免疫应答规模的免疫调控作用。TNF-α被发现与IΦN协同激活巨噬细胞合成NO并可限制肉芽肿病理组织规模减少组织病理损伤,在临床发现具有阻止潜伏结核进展为活动性肺结核的作用。而IL-2是重要的 细胞生长因子。由此近年认为同时分泌IFN-γ、 IL-2、TNF-α的多功能T细胞(multi-functional CD4+Th)才是结核免疫保护的关键。此外,CD8+T (CTL)细胞通过多种杀伤机制诱导感染的巨噬细胞凋亡,可使隐匿的结核菌有效释放结核抗原激活特异性T细胞应答。关于B细胞和抗体应答在抗结核免疫保护的作用迄今争议较大。B细胞分泌抗体IgG经FcR调理、激活巨噬细胞等的吞噬杀伤功能、作为APC提呈结核抗原激活T细胞的功能发挥一定效应。近年随黏膜(局部)免疫与黏膜免疫器官的理论的提出和不断重视,黏膜局部免疫微环境的多种免疫细胞与免疫分子的平衡对于控制感染、疾病进展十分重要,如早期的肺泡局部嗜中粒细胞浸润、巨噬细胞激活、IFN-γ产生；早中期的Th1、Th17、CTL浸润和杀伤功能增强；后期的Treg、IFN-γ、TNF-α等免疫调控应答等。这些应答均有别于全身(脾脏)免疫应答。肺脏组织被认为是一种新的黏膜免疫组织,存在独特的支气管相关淋巴组织(BALT),其中含有结构较为松散的T/B/DC等免疫细胞。Mtb感染肺泡巨噬细胞后,提呈抗原激活BALT中的Th细胞,进而激活特异性B细胞和CD8+T细胞,活化的效应B、T细胞通过趋化因子移动至黏膜效应局部,分泌SIgA,发挥T细胞效应,因此肺泡局部黏膜免疫很可能在抗结核免疫保护中发挥非常关键的作用。SIgA是人体黏膜部位的主要抗体类别,其为双体结构,中和活性显著高于单体IgG,SIgA不仅可中和胞外游离的黏膜体液中的病原体,还可以经pIgR受体主动转运至上皮细胞内,发挥胞内中和作用；胞内IgA病原复合物还可被TRIM21泛素化经由蛋白酶体降解。研究提示呼吸道支气管黏膜局部的SIgA对于中和胞外及胞内Mtb,及调节其他抗结核保护免疫具有重要的意义。肺结核的防治迄今仍面临很多未解的问题,从增强黏膜免疫角度出发,可从早期呼吸道及肺灌洗液SIgA的中和预防、肺黏膜局部多功能T细胞应答的增强,来显著克服常规疫苗不能诱导的肺脏局部抗结核免疫,从黏膜局部免疫的新角度来实现更好的免疫保护效果。综上,我们对于新型结核疫苗的设计理念聚焦于多特异性T细胞免疫和结核特异性黏膜免疫。为了诱导多抗原特异性T细胞免疫,我们将采用多表位核酸疫苗(poly-epitope vaccine)的策略,偶联多个具有免疫原性的结核T细胞表位,包括CD4+和CD8+T细胞表位,试图诱导多个结核抗原特异性的黏膜局部的T细胞应答,通过攻击结核菌多个靶抗原实现更好的免疫保护。为了诱导结核特异黏膜免疫,通过黏膜递送载体制备和组装一种易于通过黏膜、长效释放抗原的黏膜疫苗,并试图发展新的分子策略来增强黏膜的靶向性；在多表位核酸疫苗分子设计上,针对抗原表位免疫原性很弱,我们选择免疫原性非常强的蛋白作为载体支架,在其非功能结构域内插入多个T细胞表位,使T细胞表位获得一种良好的空间折叠与构象,这一设计理念也被称为“多表位蛋白支架疫苗(poly-epitope in protein scaffold, PEPS)"设计。这一设计的优点和创新在于：1)就抗原数目种类而言,偶联了多个蛋白及表位；2)蛋白本身的强免疫原性保留；3)表位由于良好的空间呈现,使得被APC吞噬后的酶类降解更为有效精准；4)多表位嵌合至蛋白中,可能产生很多新的B细胞表位和T细胞表位。蛋白载体的选择上,我们选择了来源于Mtb的热休克蛋白65 (heat-shock protein 65, HSP65)。HSP65是一种原核及真核生物的高度保守蛋白,是胞内分子伴侣,可携带运输抗原、使避免降解并正确,最终促进抗原的MHC提呈；最新研究表明HSP65可与APC如DC表面的TLR2/4作用,从而具有靶向DC并激活DC释放RANTES等细胞因子功能,被认为具有佐剂潜能。同时Mtb来源HSP65本身具有很强免疫原性和免疫保护特性。为此,我们选择结核来源HSP65作为疫苗骨架蛋白,将多个结核T细胞表位插入其非功能结构域,构建以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗(poly-epitope in protein scaffold vaccine, PES)在黏膜递送载体选择上,我们首先选择脱乙酰壳聚糖(chitosan)这一具有无毒、缓释、促进黏膜吸附吸收等特性的天然阳离子多糖,其可与DNA共凝集形成纳米颗粒型复合物,不仅使抗原质粒得以在黏膜局部缓释,所形成的100-500nm大小的颗粒更易被黏膜局部的M细胞、巨噬细胞等进行吞噬,提高抗原摄取效率。运用这一载体技术,我们课题组前期曾成功制备了chitosan-DNA结核与病毒性心肌炎黏膜疫苗,均通过增强黏膜免疫提高了免疫保护。诱导肺黏膜特异性T细胞应答及SIgA分泌可能是增强抗结核免疫保护的新思路。为了诱导全面的肺局部黏膜免疫,本课题设计制备了一种以结核优势抗原HSP65为支架、嵌合多个结核抗原T细胞表位的多T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗(pPES);在此基础上,为高效诱导肺泡局部黏膜免疫以发挥更有效抗结核保护,以天然阳离子多糖-脱乙酰壳聚糖(chitosan, CS)为黏膜递载体(佐剂),经滴鼻免疫,诱导多抗原特异性肺黏膜免疫,并以大剂量BCG攻毒评估了其免疫保护效果。为进一步提高该疫苗的黏膜靶向和抗原释放效率,针对结核分枝杆菌感染肺泡巨噬细胞的特性,我们设计使用黏膜靶向分子---甘露糖,以甘露糖修饰的壳聚糖(mannosylated chitosan, MCS)组装DNA疫苗,进一步增强其黏膜免疫效果,以期接近甚至超过BCG的保护能力。本研究的创新性在于以诱导肺黏膜局部特异性免疫为目标的一种新型黏膜疫苗设计平台的建立。第一部分 多表位DNA疫苗的设计、构建、表达与免疫原性鉴定1、以HSP65为骨架的嵌合多T表位核酸疫苗pPES的分子设计根据文献我们选择了5个结核分枝杆菌毒株H37Rv来源的T细胞表位,其中4个CD4+Th1表位ESAT-61-20(BCG缺失)、Ag85B244-255、PPE25241-255、PE194-18,1个CD8+CTL表位,MTB10.43-11,根据相似蛋白二级结构相容的原则,我们在H37Rv株来源的HSP65蛋白的第146、151、157、395位氨基酸后分别插入ESAT-61-20、Ag85B241-255、MTB10.43-11、PPE25241-255-AAY-PE194-18串联表位。首先构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65,通过多次引物重叠延伸PCR,得到插入有5个T细胞表位的HSP65的PES基因片段,而后将其插入pcDNA3.1,得到pPES多表位结核疫苗质粒,经双酶切及DNA测序均证实构建成功。构建好的pPES序列经二级蛋白结构分析,对载体HSP65基本二级结构的影响很小。作为多表位嵌合设计的对照,我们构建了将表位直接串联插入至pcDNA3.1中的质粒p5pep,以及将表位串联后插入HSP65末端的质粒pHSP65-pep。2、HSP65蛋白的纯化表达构建pET32a HSP65质粒,转化BL21,IPTG诱导,并经包涵体纯化HSP65蛋白,纯化蛋白纯度大于90%,Western Blot鉴定和小鼠抗HSP65抗体特异结合。3、pPES质粒的真核表达效率为验证p-PES质粒的真核表达效率,将pPES转染293T细胞,Western Blot转膜并以抗HSP65抗体检测,证实pHSP65、pPES在体外真核细胞能够高效表达HSP65蛋白(65kD)及PES蛋白(75kD)4、pPES疫苗诱导的特异T细胞应答及与其他方式构建疫苗的比较为证实我们构建的嵌合有5个结核T细胞表位的HSP65载体多表位核酸疫苗的免疫原性,并比较这样的蛋白载体嵌合表达与非嵌合式串联表达、及无蛋白载体的表位串联的免疫原性的差异,以pcDNA3.1、pHSP65、pPES、p5pep、 pHSP65-pep DNA疫苗以肌肉注射方式,免疫雌性C57BL/6小鼠股四头肌,4次,间隔10天,每次50μg,总量200μg。末次免疫后10天取小鼠脾脏淋巴细胞,用灭活H37Rv、HSP65蛋白、5种单独表位多肽、5肽混合物分别进行刺激,进行IFN-γ的ELISPOT检测。结果显示：5种表位的简单串联(p5pep)几乎不能有效诱导特异性T细胞应答；pHSP65只能对载体HSP65产生高效T应答；5种表位串联于HSP65羧基端(pHSP65-pep)可产生一定的T细胞免疫,但是5种表位嵌入HSP65的pPES疫苗对5种结核肽及混合肽均有更显著增强的IFN-γ+T细胞免疫,且对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示我们构建的pPES疫苗确实比表位的其他构建方式具有更好的诱导T细胞应答的优越性。5、pPES疫苗的免疫保护效果以1×107CFU BCG滴鼻攻毒4周,取小鼠肺石蜡切片行H&E染色发现：pcDNA3.1载体组与p5pep组肺部呈现严重的肺结核炎症,提示表位直接串联无保护效果；pHSP65免疫组肺泡间隔增厚程度降低,具一定的免疫保护性；pHSP65-pep组的肺泡结构与炎症较前3组均有显著降低；而pPES疫苗组显示相对最佳的炎症减轻的免疫保护效果。肺、脾脏菌落计数显示：pPES疫苗降低脏器细菌生长的效果最为显著,由106.5和105.5显著降至105.4和104.6,提示我们构建的以HSP65为骨架的多表位核酸疫苗pPES相对其他方式构建的多表位疫苗具有更好的免疫保护特性。第二部分脱乙酰壳聚糖组装的结核DNA疫苗诱导的黏膜免疫与保护效果1、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性体液免疫为明确CS-pPES疫苗滴鼻免疫能否诱导载体蛋白HSP65特异性抗体,以CS-vector阴性对照,CS-pHSP65, CS-pPES分别滴鼻免疫,BCG皮下注射作为阳性对照,每只50μg DNA,隔周免疫4次。血清IgG水平方面：CS-vector对照组不能诱导血清IgG,其余各组均在6周起诱导,第8周达到峰值。CS-pPES滴鼻免疫诱导了显著高于对照组和CS-HSP65组的血清IgG,低于BCG组。提示在HSP65蛋白中插入5个结核表位并未显著影响HSP65载体蛋白诱导抗体应答的能力。为检测CS-pPES滴鼻免疫是否能诱生黏膜SIgA,取末次免疫后两周小鼠肺泡灌洗液(BAL)检测显示：CS-pPES疫苗滴鼻诱导了高水平的肺泡灌洗液SIgA,显著高于各组,与BCG组无显著差异。提示CS-pPES滴鼻免疫不仅可诱导血清IgG抗体,同时显著诱导了HSP65特异性黏膜SIgA。2、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性全身(脾脏)T细胞免疫为了检测CS-pPES滴鼻免疫诱生的特异性T细胞免疫,取末次免疫后2周小鼠脾脏淋巴细胞悬液,体外H37Rv、HSP65蛋白、5种表位多肽及5肽混合物分别刺激培养40h,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组脾脏淋巴细胞对所有结核抗原刺激均产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均高于CS-pHSP65和对照组(p<0.05),但略低于BCG组；此外,仅有CS-pPES免疫小鼠脾细胞对Mtb特有而BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应。流式细胞术方法检测了脾脏分泌多种细胞因子的T细胞频率。经灭活H37Rv刺激结果显示：CS-pPES免疫小鼠脾细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,虽总体水平比BCG组略低,但均显著高于对照和CS-pHSP65载体组(p<0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显著诱导脾脏CD4+和CD8+多功能T细胞应答。3、CS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的特异性肺局部黏膜细胞免疫取末次免疫后2周小鼠肺脏淋巴细胞悬液,进行IFN-γ的ELISPOT检测发现：CS-pPES组肺脏淋巴细胞对几乎所有结核抗原(PPE25和PE19多肽较弱)刺激产生了较高水平IFN-γ+T细胞应答,均显著高于CS-pHSP65和对照组(p<0.05)；还对BCG缺失的ESAT-61-20有良好反应,提示CS-pPES滴鼻免疫诱导了肺脏黏膜局部多抗原特异性IFN-γ+T细胞应答,但略低于BCG效果。流式细胞术结果显示：CS-pPES免疫小鼠肺单核细胞诱导了结核特异性分泌3种细胞因子的CD4+和CD8+T细胞应答,总体水平显著高于BCG、及对照和CS-pHSP65载体组(p<0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可显著诱导肺脏黏膜局部CD4+和CD8+多功能T细胞应答,且该应答显著高于阳性对照BCG。4、CS-pPES疫苗滴鼻免疫的抗结核免疫保护大剂量BCG滴鼻攻毒后4周,肺脏病理结果显示,BCG皮下免疫组显示了最好的免疫保护效果；而CS-PES滴鼻免疫组肺脏病理显著优于CS-pHSP65疫苗组和对照,虽仍有肺泡细胞壁增厚和少量炎症。攻毒后肺、脾细菌数由105.8、105.1显著降低为104.6、104.4,提示CS-pPES结核黏膜疫苗滴鼻免疫能部分保护小鼠,但总体效果低于BCG疫苗。综上,我们构建的含有5个结核T细胞表位的pPES多表位核酸疫苗,经chitosan组装后,经滴鼻免疫,显著增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺脏IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+T细胞应答,但在脾脏T细胞免疫强度和攻毒炎症保护方面效果略低于BCG疫苗。有待进一步优化和改进这一黏膜疫苗。第三部分甘露糖化壳聚糖增强DNA疫苗的黏膜免疫与保护效果为进一步增强结核特异性黏膜免疫,我们将黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰,而后与质粒DNA通过共凝聚法形成MCS-pPES复合物颗粒疫苗,研究其理化特性并在小鼠体内的检测其免疫原性和免疫保护特性。1、CS-DNA和MCS-DNA复合物的理化特性研究以壳聚糖(CS)及甘露糖化壳聚糖(MCS)溶液,分别与质粒pPES复合形成CS-DNA和MCS-DNA复合物颗粒。经扫描电镜证实复合物为均一的球形颗粒,MCS-DNA颗粒约250-400nm,略大于CS-DNA。CS和MCS包装DNA效率将近100%,并可有效保护DNA免受DNA酶的降解。2、MC-pPES疫苗滴鼻免疫诱生的特异性抗体免疫应答以MCS-pPES、CS-pPES、pPES、MC-vector、CS-vector结核黏膜基因疫苗于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射为阳性对照。MCS-DNA诱导的血清IgG效价近1：4000,显著高于DNA组,高于CS-DNA组(1：2800)。MCS-DNA免疫诱导的肺灌洗液SIgA效价为1：1100,显著高于CS-DNA和BCG诱导SIgA(1：600,p<0.05)；提示对黏膜递送载体壳聚糖进行甘露糖化修饰可显著增强特异性黏膜抗体特别是SIgA应答。3、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的全身(脾脏)特异性T细胞免疫ELISPOT显示,与CS-pPES相比,MCS-pPES滴鼻免疫显著增强了各表位及结核抗原特异性IFN-γ+T应答,且与BCG组相仿；同时对BCG缺失的ESAT-61-20抗原的应答水平显著高于BCG。流式细胞术显示：MCS-pPES滴鼻免疫诱导的H37Rv特异性脾脏三细胞因子多功能T细胞应答强度(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD8+T、TNF-α+CD4+T)均比CS-pPES疫苗效果显著增强,略低于BCG。5肽特异性脾脏多功能T应答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T)在MCS-pPES均显著性高于CS-pPES (p<0.05) TNF-α,+T显著高于BCG组(p<0.05),提示MCS-pPES滴鼻免疫显著增强H37Rv、5肽特异性脾脏多功能T细胞应答。4、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫诱导的肺黏膜局部特异性T细胞免疫ELISPOT显示：MCS-pPES疫苗又显著增强了CS-pPES及裸露DNA诱导的肺脏单核细胞IFN-γ+T应答；且对5肽和HSP65蛋白的应答均显著高于BCG组(p<0.05)流式细胞术显示：MCS-pPES组诱导的H37Rv特异性肺脏多功能T应答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、TNF-α+CD4+T)均显著高于CS-pPES组及对照组(p<0.05),与BCG组近似。MC-pPES诱导的5肽特异性肺脏IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、 TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显著高于CS-pPES,且高于BCG组(p<0.05),提示甘露糖化壳聚糖组装的pPES疫苗显著增强5肽特异性肺黏膜多功能T细胞应答,不仅优于CS-pPES,且优于BCG疫苗。5、抗结核免疫保护效果裸露DNA疫苗滴鼻免疫的保护效果有限：MCS-pPES黏膜疫苗的肺结核免疫保护效果与CS-pPES相比显著增强,肺脏炎症浸润灶及炎症程度显著减少,肺脏细菌载量显著降低,与BCG效果相仿。综上,为提高壳聚糖递送的多表位结合疫苗的免疫原性和免疫保护,使用修饰的甘露糖化壳聚糖作为黏膜递送载体,发现在特异性血清IgG、肺灌洗液SIgA、脾脏和肺脏IFN-γ+T细胞应答均显著高于壳聚糖疫苗效果,其中,肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、肺脏5肽特异性IFN-γ+CD4+/CD8+T、 IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显著高于CS-pPES及BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显著提高。最终的免疫保护效果也得以显著提高。第四部分甘露糖化壳聚糖特异靶向肺泡巨噬细胞的机制研究为了探讨甘露糖化壳聚糖增强黏膜免疫应答的机制,我们通过几种报告抗原的原位组织染色及免疫组化方法检测了疫苗在肺脏的表达效率,并通过双荧光共聚焦评估了两种黏膜疫苗的肺泡靶向特性。1、原位组化检测MCS-DNA的肺脏表达效率为了在体内验证壳聚糖和甘露糖化壳聚糖对于DNA疫苗的递送与表达效率,β-半乳糖苷酶为报告抗原：以含50ug质粒DNA的CS-pLacZ及MCS-pLacZ滴鼻免疫小鼠。2天后取小鼠肺脏X-gal染色发现：裸露质粒无法在肺脏有效表达；CS-p-LacZ质粒在肺泡间质有少量表达：而MCS-pLacZ滴鼻小鼠肺泡间质及肺泡细胞内LacZ的表达量和表达区域显著高于其余两组,提示壳聚糖与甘露糖化壳聚糖均可增强外源DNA在肺部的原位表达,且甘露糖化壳聚糖增强抗原黏膜表达的能力最强。HSP65为报告抗原,48小时小鼠肺脏冰冻切片经HSP65特异性抗体染色发现：CS-pHSP65显著提高肺脏间质和细胞内HSP65抗原表达,而MCS-pHSP65的增强效果更为广泛和强烈,提示壳聚糖和甘露糖化壳聚糖均可显著增强DNA在肺部的原位表达,以后者的增强效果更为显著。2、FITC示踪MCS-DNA的肺脏巨噬细胞靶向情况为了检测甘露糖化壳聚糖是否可以有效靶向肺泡巨噬细胞,分别以FITC标记壳聚糖和甘露糖化壳聚糖,而后以含50ugDNA的FITC-CS-DNA及FITC-MCS-DNA通过气管灌注小鼠肺脏,取24小时肺脏冰冻切片,以抗小鼠单核+巨噬细胞抗体(MOMA-2)进行特异染色,DAPI衬染,以共聚焦荧光显微镜观察,结果显示：小鼠肺泡巨噬细胞附近有一定的CS-DNA的荧光强度,而经MCS-DNA免疫后,肺泡局部绿色荧光的数目和强度均有显著提高,提示MCS-DNA比CS-DNA更能有效地到达肺泡巨噬细胞,即靶向性显著增强。3、FITC示踪MCS-DNA的巨噬细胞摄取能力为进一步探究甘露糖化壳聚糖递送系统指引下的肺泡巨噬细胞靶向后,对巨噬细胞的抗原摄取能力是否有影响,体外Raw264.7细胞,加入含2μg质粒DNA的FITC标记的CS-pPES及MCS-pPES,孵育0.5小时后共聚焦激光显微镜检显示：巨噬细胞细胞对于CS-pPES的摄取能力有限,而MCS-pPES对抗原的摄取能力显著增强,提示经甘露糖修饰的壳聚糖递送系统可增强巨噬细胞对疫苗复合物的摄取能力。综上,我们创新性设计并构建了多结核T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗pPES,并证实该表位嵌合构建方式的免疫效果显著优于表位简单串联、表位串联后与HSP65串联。为诱导结核特异性黏膜免疫,增强早期肺黏膜局部的SIgA(?)黏膜T细胞免疫,以壳聚糖作为黏膜递送载体对多表位DNA疫苗予以组装。CS-pPES疫苗经滴鼻免疫,显著增强了裸露DNA所不能诱导的肺灌洗液SIgA和肺单核细胞IFN-γ+T细胞应答：而整体T细胞应答强度和抗结核保护效果仍低于BCG。为进一步增强黏膜免疫,对壳聚糖进行甘露糖化修饰而后制备MCS-pPES黏膜结核疫苗。证实其滴鼻免疫诱导的各项全身免疫和黏膜免疫显著高于CS-pPES疫苗：不仅如此,在肺灌洗液SIgA、肺脏单核细胞5肽特异性IFN-γ+T应答、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T应答均显著高于BCG组,提示诱导肺脏黏膜免疫的能力得以显著提高。最终的免疫保护效果也得以显著提高。经体外机制的探讨,证实对递送载体甘露糖化的设计的确显著增强了肺泡巨噬细胞靶向、肺泡抗原表达和巨噬细胞摄取。这一黏膜靶向性载体(佐剂)设计策略兼顾了黏膜靶向和黏膜APC功能增强功能,预期在增加我们的结核疫苗的表位种类和组合基础上(目前仅5个表位,偏少),可实现更为有效可观的结核疫苗保护效果。本研究为多表位结核疫苗的分子设计及新型结核黏膜疫苗设计提供了新思路,为肺结核的免疫保护机制提供了有关肺脏黏膜SIgA和黏膜T细胞应答的有益补充。制备的两种结核黏膜疫苗在进一步增加优势抗原表位组合基础上,有望获得更为高效的黏膜免疫与结核保护效果。