2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是合成D-异抗坏血酸钠(EN)及D-异抗坏血酸(EA)的前体物质,也可转化为D-酮糖、D-阿拉伯糖。2KGA本身也可作为水泥增塑剂、洗涤剂和除草剂等,具有很高的工业生产价值。首先,比较了常用几种检测2KGA的方法,建立了简易粗略的碘量法检测技术以及直观精确的液相色谱检测技术。其中,液相色谱检测条件为:美国Agilent液相色谱仪,伯乐Aminex HPX-87H色谱柱,流动相为0.005 M H2SO4,柱温55℃,流速0.6 mL/min,检测波长210 nm,进样量20μL,该方法快速、准确、重现性好。对实验室存有的一株产生2KGA的菌株,进行了 16SrDNA测序,经数据库信息比对,鉴定为恶臭假单胞茵(Pseudomonas putida),命名为P.putida KD-1。研究了该菌株的碳源、氮源、渗透压、pH等条件对2KGA产量影响,发现这株菌2KGA产量在15-22 g/L之间,总体产量偏低,而且菌株在高渗透压培养基中生长缓慢,发酵周期长,研究开发潜力不大。进而对保藏的一株葡萄糖酸杆菌Gluconobacter suboxydans J12(简称J12)进行了发酵实验研究,与P.putida KD-1对比,J12可在较高的葡萄糖浓度下耐受生长,葡萄糖代谢速度快,发酵72 h后,J12产生2KGA产量达到29.5 g/L。但由于J12细胞含有多种脱氢酶,既可以转化葡萄糖生成2KGA,也可以转化葡萄糖生成5KGA,不仅降低了葡萄糖生成2KGA的产率,同时发酵产物难以分离纯化,因此希望通过定向遗传操作技术,敲除生成5KGA的脱氢酶基因,有望进一步提高2KGA的产量。通过引物设计、质粒转化、抗生素筛选等步骤的分子操作,获得了转化子J12-1,分子验证己实现了基因敲除,液相色谱检测发酵液产物只含有2KGA,优化发酵条件后,突变株J12-1的2KGA产量可达39.6g/L。进一步进行了 J12-1突变株2 L自动发酵罐的发酵实验,葡萄糖总加入量400 g,72h发酵终了发酵液的体积为2 164mL,最终获得2KGA为162.58 g,即75.13 g/L,质量收率为40.65%,摩尔转化率为37.99%。实验又进一步探索了 J12-1静息细胞转化葡萄糖生成2KGA的情况,由于催化葡萄糖到2KGA的脱氢酶,都位于Gluconobacter suboxydans J12-1的细胞膜上或周质空间内,因此处于静息状态的活细胞仍然具有催化活性,理论上可以直接将葡萄糖转化为葡萄糖酸,进而再转化为2KGA。研究了只含有60 g/L的葡萄糖溶液为底物,接入发酵36h的J12-1离心后的活菌体,有氧转化72h,可以获得的高纯度2KGA.转化液。当菌浓达到20 g/L,可几乎将葡萄糖100%转化为2KGA。