牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染可引起牛等多种经济动物腹泻/黏膜病,急性感染引起免疫抑制,妊娠母牛感染BVDV引起免疫耐受和犊牛持续性感染（Persistent infection,PI）,给畜牧业生产造成严重经济损失。现有疫苗不能对不同地域的流行毒株基因型和基因亚型提供完全免疫保护效果,寻找和开发抗病毒药物迫在眉睫。二甲双胍（Metformin,Met）不仅用于2型糖尿病的研究,还能够延长机体寿命、治疗自身免疫疾病、减少内皮功能障碍、改善神经退行性疾病、在多种类型癌症中发挥抗肿瘤作用,但Met是否具有抗BVDV复制的功能尚未见研究报道。本试验探索Met是否影响BVDV体内外复制,其机制如何?具体内容如下:1.Met影响BVDV体内外复制的研究使用MTT法检测Met对牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney,MDBK）的半抑制率(IC50,half maximal inhibitory concentration);使用BVDV感染Met处理MDBK细胞通过免疫荧光染色、荧光定量PCR、细胞病变效应和半数细胞感染量等检测Met对BVDV胞内复制的影响;通过q RT-PCR和病理切片观察组织病变检测Met预防和治疗BVDV在小鼠体内复制情况。试验结果表明:Met作用于MDBK的IC50为13.15 m M;Met可显著减少BVDV双链RNA（Double strand RNA,ds RNA）的累积、显著抑制BVDV m RNA转录水平、CPE现象明显减弱、病毒滴度显著降低;Met对BVDV在小鼠预防和治疗试验显著降低内脏组织中BVDV m RNA转录水平,有效缓解病毒感染引起的肝、肾、脾和小肠病变,表明Met抑制BVDV体内外复制。2.RNA-seq分析Met对BVDV感染MDBK的转录组差异表达情况通过RNA-seq分析NC、Met、BVDV和Met BVDV作用于MDBK细胞差异性,分析差异表达基因及其主要富集的通路。试验结果表明:RNA-seq分析Met vs NC和Met BVDV vs BVDV分别确定了3169和2510个差异表达基因,GO功能富集、KEGG和GSEA分析表明差异表达基因主要富集于自噬、线粒体自噬、NF-κB、MAPK、PI3K-Akt等信号通路,其中在细胞自噬信号通路中可极显著性改变自噬相关基因ATG2A、ATG4B、ATG10和ATG12等的表达。3.Met影响细胞自噬的分子机制使用Western blot、激光共聚焦显微镜、透射电镜等检测Met对细胞自噬水平影响;Pull down和分子动力学模拟分析检测Met与ATG10蛋白的相互作用和结合位点。试验结果表明:Met处理细胞可显著促进自噬活性,通过激活ATG10的泛素化连接酶,促使自噬前体复合物ATG5-ATG12形成,促进细胞自噬体双层膜的延伸和自噬体成熟,进而增加细胞自噬水平;分子动力学模拟分析显示Met与ATG10蛋白的Leu116,His131,Leu114等位点结合。4.Met通过细胞自噬影响BVDV复制的机制研究使用激光共聚焦显微镜、透射电镜和Western blot等检测BVDV对细胞自噬活性的影响;使用CRISPR/Cas9技术敲除MDBK细胞ATG10基因,Western blot检测敲除效率及Met对ATG10 KO细胞的自噬水平影响,检测ATG10 KO细胞对BVDV复制的影响;将ATG10全基因及其突变体回补至ATG10 KO细胞,检测Met对其自噬水平影响及BVDV复制情况。试验结果表明:BVDV感染Met处理的细胞可以激活自噬水平,促进自噬体和溶酶体的融合;Met作用于ATG10 KO细胞几乎不影响自噬水平,敲除ATG10基因可抑制BVDV复制;使用Met作用于ATG10全基因回补的细胞可影响自噬水平而抑制BVDV复制。本研究发现Met抑制BVDV体内外复制,Met处理细胞能够显著增强自噬活性,与ATG10的Leu116,His131,Leu114等位点结合,激活其泛素化连接酶,促使自噬前体复合物ATG5-ATG12形成,促进细胞自噬体双层膜的延伸和自噬体成熟,进而增加细胞自噬水平促使BVDV包裹到自噬体并与溶酶体结合,进而降解BVDV,阻止BVDV复制。为后续研究Met对BVDV的临床应用及新药物研发的靶点提供理论依据。