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建立在细胞免疫基础上的γ干扰素释放实验(IFN-gamma release assays, IGRAs)近年来获得了较快的发展,IGRAs通过对结核分枝杆菌特异性的抗原刺激后的IFN-γ释放进行检测来判断机体是否存在结核菌的感染。目前商品化的IGRAs共有两种,一种为QuantiFERON TB Gold In-Tube test (QFT; cellestis, Carnagie, Australia),另一种为T-SPOT.TB test (Oxford Immunotech, Abingdon, UK)。IGRAs在结核病的临床检测中获得了一定程度的应用,与传统的结核菌素试验(Tuberculin skin test, TST)相比较,IGRAs在BCG广泛接种地区具有较低的假阳性率并且与结核病的高危因素具有较高的相关性。但现有的IGRAs仍然存在诸多缺陷,限制了其在结核病诊断中的应用,主要集中在敏感性仍然有待提高,以及会出现较多无法判定的结果,特别是在重症结核和伴有免疫抑制的结核病患者中。此外,目前的IGRAs只能够检测结核杆菌的感染,而不能够区分活动性结核和潜伏性结核感染。在结核病高流行的地区和国家,由于潜伏性结核感染的比率较高,使IGRAs的在临床诊断中的应用受到了极大地限制。为了改进现有的IGRAs诊断方法,一方面可以增加结核杆菌特异性的抗原,另一方面可以检测除IFN-γ以外的其它诊断标志物。本研究首先在结核杆菌基因组的RD区中筛选新的结核杆菌特异性抗原。结核杆菌基因组的RD区(Region of differentiation)在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌中是缺失的,RD区是结核杆菌免疫诊断特异性抗原筛选的首选区域。在前期研究中,通过对RD2及RD11抗原的体外表达和纯化得到RD2区和RD11区抗原的重组蛋白,对其诊断价值进行了初步的筛选。本研究对其中具有最高诊断价值的抗原Rv1985c和Rv3425进行了的T细胞抗原表位的作图和分析。应用基于全血的IFN-γ释放实验,我们以覆盖Rv1985c和Rv3452氨基酸序列全长的多肽作为抗原,在活动性结核病人,潜伏性结核感染者和BCG接种的健康对照中对其表位进行了筛选,从中选取特异性抗原表位多肽组成多肽混合物,并进一步进行验证。结果表明在我们所选取的多肽混合物中,Rv1985cpool2, Rv1985cpool4和Rv3425pooll均具有较高的诊断价值,敏感性最高为53.9%,特异性为95.5%。将这些多肽混合物与QFT联用能够提高诊断的敏感性从86.4%到96.2%,而不影响诊断的特异性。因此,本部分研究的结果表明应用表位作图方法筛选出的特异性Rv1985c和Rv3425的抗原表位多肽对结核病具有较高的诊断价值,可以在BCG接种人群中应用于结核病的诊断。另一方面为了筛选新的诊断生物标志物,我们应用高通量的悬液芯片技术,在28例活动性结核病人,34例潜伏性结核感染者及26例健康对照者中,对外周全血受结核特异性抗原刺激及基础分泌水平的27种炎症因子谱进行了分析和筛选。结果表明结核特异性抗原刺激后的IFN-γ,EP-10,IL-2,MCP-1,IL-1RA,IL-15和未受抗原刺激的VEGF,IP-10,IL-12,MCP-1,MIP-1b释放量在结核感染组(包括活动性结核和潜伏性结核感染)中均明显高于健康对照组。在27种炎症因子中,基础分泌水平的VEGF,PDGF,IL-12,IP-10和结核特异性抗原刺激后的IFN-γ和PDGF在活动性结核组中明显高于潜伏性结核感染组。当联合应用VEGF,IL-12和PDGF能够区分活动和潜伏性结核感染,其敏感性和特异性分别为79.4%和92.9%。这些结果表明,建立在现有IGRAs基础上通过对VEGF,IL-12和PDGF等进行检测可以作为一种新的快速诊断方法,能够应用于区分活动性结核病和潜伏性结核感染。接下来本研究选取前期筛选出的具有较高诊断价值的标志物IP-10和IL-2,进一步验证并评价其在结核高流行,BCG广泛接种地区诊断结核病的表现。我们共收集了活动性结核病人66例,潜伏性结核感染者73例和健康对照77例,对其外周全血受结核特异性抗原刺激后的IP-10和IL-2释放量进行了检测。结果表明,IFN-γ,IP-10和IL-2在活动性结核组中诊断的阳性率分别为86.4%,89.4%和86.4%,在潜伏性结核感染组中为38.4%,57.5%和39.7%,在健康对照组中为17.1%,18.4%和14.5%。在活动性结核病人的密切接触者中,与TST相比较,IP-10和IL-2与结核感染的高危因素具有较高的相关性。此外IP-10和IL-2的联用可以降低出现无法判定结果的几率。IP-10和IL-2与QFT联用可以将敏感性提高到95.5%而并不影响特异性,无法判定结果比率下降为0.4%。此外,我们还发现IL-2/IFN-γ能够区分活动性结核病和潜伏性结核感染,其敏感性为77.2%,特异性为87.2%。综上所述,本研究一方面确定了Rv1985c和Rv3425两个抗原的特异性的T细胞表位多肽,并证实了其在诊断结核病中应用价值和对现有抗原的补充作用。另一方面,本研究也通过悬液芯片技术筛选出了能够区分活动性结核病和潜伏性结核感染的新型诊断生物标志物。此外本研究也系统评价了IP-10和IL-2在结核病诊断中的应用,证实其与现有IGRAs联用能够增加诊断的敏感性并降低出现无法判定结果的比率。这些新型的抗原和诊断标志物均能够极大地改进现有的基于细胞免疫的结核病诊断方法,使其能够更好地应用于结核病的诊断。