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背景随着社会人口老龄化和人民生活水平提高,冠心病已经成为危害人类健康的主要疾病之一。对于缺血性心脏病的治疗,最重要的是恢复心肌血液灌注,解除心肌组织缺血、缺氧和营养物质供应不足的情况。再生的血管可以很大程度上改善心肌的供血,从而缓解疾病的进展。心肌缺血缺氧后如何促进血管再生、改善微循环的研究越来越受到重视,这已经成为缺血性心脏病,尤其是糖尿病性心肌病治疗学研究的重点方向之一。近期研究发现,周围组织分泌的载脂蛋白A-I结合蛋白(Apo A-1 Binding Protein,AIBP)可以抑制血管形成。那么从理论上推断,阻断AIBP活性可以刺激血管再生长,但目前AIBP在心肌微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs)以及心肌组织中的作用尚无报道。为此我们研究阻断心肌血管AIBP活性是否可以刺激心肌缺血后心脏微血管生成和新生,从根本上解决缺血性心脏病和许多终末期心力衰歇患者的心肌微循环障碍问题,从而改善心肌细胞生存的微环境和营养能量物质的供给,为寻找缺血性心脏病的潜在新治疗靶点奠定一定的理论基础。目的1.探讨大鼠CMECs体外分离、培养及鉴定的方法和慢病毒转染、筛选及阻断大鼠AIBP基因的表达情况。2.观察阻断AIBP基因的表达对大鼠CMECs血管再生功能的影响。3.动物实验研究阻断心肌血管AIBP基因表达对大鼠心梗后冠脉微血管再生的影响。方法1.大鼠CMECs体外分离培养和鉴定以及慢病毒转染筛选采用混合酶消化法和差速贴壁法分离SD大鼠CMECs,并采用乙酰低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)吞噬检测法进行鉴定,取P2-P3 CMECs进行慢病毒介导的AIBP sh RNA转染,阻断CMECs AIBP基因表达。采用RT-PCR和Western Blot检测正常及转染后的CMECs AIBP基因和蛋白的表达水平,筛选出有效阻断AIBP表达的基因序列。2.阻断AIBP基因表达对CMECs血管再生能力的研究取P2-P3 CMECs进行阻断AIBP基因表达转染,与Control组和L-NC组进行比较,采用Westren Blot检测细胞内VEGFR2和p AKT蛋白的表达、Alama Blue比色法检测细胞增殖能力、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力、Matrigel基质胶管样结构形成实验检测细胞血管再生能力。3.动物实验观察阻断大鼠心肌血管AIBP的表达对心梗后微血管再生的影响建立大鼠心梗模型并于心梗处注射慢病毒,采用Western Blot检测正常及转染后的心肌中AIBP蛋白的表达水平、免疫组化检测CD31的表达水平、Masson三色法检测心肌纤维化程度和心脏超声检测心脏功能。结果1.成功分离、鉴定大鼠CMECs,培养5 d-6 d时成熟的CMECs相互融合并紧密连接,呈多边形“铺路石样”改变,对Ac-LDL的吞噬功能正常。Western Blot检测结果与RT-PCR相互印证,成功筛选出有效阻断AIBP表达的基因序列。2.体外实验结果表明,阻断AIBP表达后上调CMECs VEGFR2的表达与AKT磷酸化水平。可提高CMECs的增殖能力、细胞迁移能力以及成管能力(P<0.01)。3.动物实验结果表明,阻断AIBP表达后心梗区域心肌微血管再生数显著增多,心梗后心肌纤维化程度显著下降、显著改善心梗后大鼠左室心功能(P<0.01)。结论阻断心肌血管AIBP基因的表达可以显著促进心肌微血管再生。体外实验中阻断大鼠CMECs AIBP基因的表达可以促进大鼠心肌微血管再生能力;体内动物实验中,阻断大鼠心肌血管AIBP基因的表达同样可以显著促进心梗后冠脉微血管再生,改善心功能。因此,阻断心肌血管AIBP基因的表达可以成为治疗缺血性心脏病的一个潜在治疗靶点,为临床促心肌微血管再生治疗提供了坚实的理论基础。