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目的:肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）作为严重危及人类健康的常见呼吸系统并发症,是很多慢性肺疾病的最终结局。PF患者的呼吸功能随着肺部损伤的加重不断恶化,其发病率和死亡率日益增加。虽然肺移植可提高PF患者的生活质量、以及延长寿命,但是捐献器官的缺乏、排异反应、感染等限制了其应用。博莱霉素（bleomycin,BLM）诱导的动物模型与人类PF病理组织学改变最为接近。BLM通过气管进入肺组织内部后,首先产生的是以肺泡上皮细胞凋亡、炎性细胞浸润、炎症细胞因子升高为特征的急性炎性肺损伤。继而出现纤维化标志物的表达增加、成纤维细胞被激活、过量的细胞外基质在肺间质中形成,同时细胞因子使炎症反应放大并进一步促进成纤维细胞增殖和分化。我们通过生信分析发现miR-130a-3p在PF患者中异常表达。课题组既往研究发现,miR-130a-3p通过靶向转化生长因子-β 受体（transforming growth factor beta receptor,TGFBR）Ⅱ进而抑制肺成纤维细胞的增殖和分化,同时还可以有效的抑制肺泡上皮细胞凋亡和炎性反应。然而miR-130a-3p对PF疾病的病理发展的作用机制研究甚少。本研究旨在探讨在PF不同阶段中miR-130a-3p的表达水平,揭示miR-130a-3p在PF炎症期和纤维化期的潜在治疗作用,同时采用了单细胞转录组测序技术对BLM诱导的小鼠PF肺组织单细胞进行数据分析,明确PF的主要效应细胞以探索miR-130a-3p在PF中的作用机制。研究方法:一、探讨miR-130a-3p对BLM诱导的小鼠PF炎症期和纤维化期的治疗作用:1.构建BLM诱导的小鼠PF模型,采用qRT-PCR和Western Blot检测炎症和纤维化相关基因和蛋白的表达情况,以明确小鼠PF炎症期和纤维化期的疾病进程。2.生物信息学分析PF中差异表达的miRNAs。3.应用qRT-PCR技术对miR-130a-3p在小鼠PF炎症期和纤维化期的表达水平进行检测。4.建立小鼠PF模型:构建炎症期和纤维化期小鼠PF模型,经尾静脉注射miR-130a-3pagomiR进行治疗后,观察小鼠肺组织形态变化;检测小鼠体重、肺湿干重比、肺系数等的改变;利用HE和Masson染色检测小鼠肺组织病理学的改变。5.miR-130a-3p在小鼠肺组织中的表达情况:应用qRT-PCR和原位杂交技术对miR-130a-3p在小鼠肺组织中的表达情况进行研究。6.miR-130a-3p对小鼠PF炎症期的影响:通过ELISA和瑞氏-吉姆萨染色法检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子分泌水平和炎症细胞的数量;应用Western Blot和qRT-PCR技术检测NF-κB信号通路相关蛋白和mRNA的变化情况。7.miR-130a-3p对小鼠PF纤维化期的影响:采用碱水解法对小鼠肺组织中HYP含量进行测量;应用Western Blot和qRT-PCR技术检测纤维化标志物、TGF-β/Smad信号通路相关蛋白和mRNA的变化情况;通过免疫荧光染色技术,观察小鼠肺组织的肌成纤维细胞数量的变化。二、对BLM诱导小鼠PF模型进行单细胞数据分析:1.应用单细胞转录组数据对BLM诱导的小鼠PF进行分析,明确PF中炎症期和纤维化期的主要效应细胞类型。2.建立疾病差异基因表达谱,并进行功能富集分析以探索PF的发病机制。三、体外验证miR-130a-3p对炎症和纤维化的影响:1.采用不同浓度/时间的LPS、NF-κB抑制剂分别处理MH-S细胞后,利用Western Blot和qRT-PCR技术检测NF-κB信号通路相关蛋白和miR-130a-3p的表达。2.通过Western Blot技术明确转染miR-130a-3p模拟物和抑制物对TNF-α蛋白的影响。3.采用不同浓度/时间的TGF-β1、TGF-βRⅠ/Ⅱ或Smad3抑制剂分别处理MRC-5细胞后,利用Western Blot和qRT-PCR技术检测纤维化标志物和miR-130a-3p的表达。4.通过CCK-8、Western Blot和免疫荧光技术明确转染miR-130a-3p模拟物和抑制物对MRC-5细胞增殖和分化的影响。5.应用双荧光素酶报告基因检测miR-130a-3p是否直接靶向TGF-βRⅡ。6.应用小干扰RNA特异性敲减MRC-5细胞中TGF-βRⅡ,通过Western Blot技术明确TGF-βRⅡ对纤维化标志物的作用。结果:一、miR-130a-3p对BLM诱导的小鼠PF炎症期和纤维化期的治疗作用:1.在BLM造模后,第7天炎症标志物TNF-α、IL-1β、IL-6显著升高,p-P65、p-IκB激活,IκB表达降低;纤维化标志物TGF-β1、α-SMA、FN、TGF-βRⅡ的表达逐渐升高,在第28天达到峰值;上皮标志物E-cadherin表达随时间逐渐降低。2.通过生信分析发现,miR-130a-3p在PF患者的肺组织中具有差异表达。3.在BLM造模后,miR-130a-3p在第7天炎症期升高,第28天纤维化期降低。4.建立miR-130a-3p治疗小鼠PF模型发现:在造模后的炎症期,小鼠体重明显下降;在纤维化期,体重快速下降,之后体重呈上升趋势;而miR-130a-3p治疗后,体重下降的程度有所减轻。Control组和单纯给予miR-130a-3p组肺组织呈均匀的粉红色,无瘀血点瘀斑、变色和肿胀;炎症期肺组织肿胀、充血;纤维化期肺组织肿胀,体积增大,组织出现瘀血和水肿。miR-130a-3p治疗组体积略膨大,偶见散在的出血点,但瘀血和水肿的程度都有改善,质地较粗糙,肺边缘锐利。炎症期和纤维化期BLM组小鼠肺湿干重比值、肺系数、肺总含水量增加,而miR-130a-3p治疗后,与单独给予BLM组相比炎症期肺组织水肿明显好转。miR-130a-3p治疗组小鼠肺组织病理切片的肺泡炎评分及纤维化评分较BLM组更低。5.miR-130a-3p在小鼠肺组织中的表达情况:与Control组相比,BLM组miR-130a-3p表达水平在炎症期升高,在纤维化期降低;注射miR-130a-3p agomiR后显著升高了其在肺组织的表达水平。6.miR-130a-3p对小鼠PF炎症期的影响:与Control组相比,BLM组的支气管肺泡灌洗液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平、细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞的数量、百分比均升高;miR-130a-3p治疗后细胞因子分泌减少,细胞数目减少。与 Control 组相比,BLM 组中 IL-6/1β、核转录因子 P65、p-IκB、TNF-α、CD14、CD68蛋白/mRNA表达上调,IκB、CD19表达下调,miR-130a-3p干预后,上述指标逆转。7.miR-130a-3p对小鼠PF纤维化期的影响:与Control组相比,BLM组的TGF-β1水平和 HYP 含量升高,α-SMA、FN、ColⅠ/Ⅲ、TGF-β1、TGF-βRⅠ/Ⅱ、Smad4 蛋白/mRNA表达增强,p-Smad2/3蛋白相对于总Smad2/3蛋白水平显著增加,而miR-130a-3p治疗后上述指标表达降低。而E-cadherin的蛋白表达与上述相反。8.miR-130a-3p对肌成纤维细胞表面标志物α-SMA的影响:免疫荧光染色结果显示不同时期BLM组肺组织的α-SMA阳性细胞数量增多,给予miR-130a-3p治疗后,α-SMA阳性细胞数量减少。二、BLM诱导小鼠PF模型的单细胞转录组的分析:1.我们将细胞注释为13类细胞,通过对比不同种类细胞的数量发现,在炎症期和纤维化期,巨噬细胞数量和成纤维细胞数量均增加,肺泡上皮细胞数量均下降。2.分析了巨噬细胞、成纤维细胞和肺泡上皮细胞的单细胞疾病差异基因表达情况。3.通过富集分析,发现巨噬细胞炎症期的差异基因富集于免疫细胞的激活、对损伤及外部刺激的反应、TNF-α产生的调节等;成纤维细胞纤维化期差异基因富集于对损伤的反应、细胞外基质及结构的构成、核糖体的生物合成等;肺泡上皮细胞主要富集于代谢反应中。三.体外验证miR-130a-3p对炎症和纤维化的作用:1.随着LPS的处理浓度的升高和时间的延长,miR-130a-3p的表达水平逐渐升高,P65、p-IκB、TNF-α的表达升高,IκB表达下调。选择10μg/mLLPS处理MH-S细胞12 h作为后续处理条件。2.NF-κB信号通路抑制剂阻断了 LPS对miR-130a-3p的诱导作用。3.转染miR-130a-3p模拟物后,MH-S细胞中TNF-α蛋白表达被抑制。4.随着TGF-β1的处理浓度的升高和时间的延长,miR-130a-3p的表达逐渐降低,α-SMA、FN、CilⅠ/Ⅲ的表达升高。选择 10ng/mLTGF-β1 处理 MRC-5 细胞 24 h作为后续处理条件。5.TGF-βRⅠ/Ⅱ和Smad3的抑制剂分别阻断了 TGF-β1对miR-130a-3p表达的抑制作用。6.转染miR-130a-3p模拟物后,MRC-5细胞的增殖和分化能力被抑制,并且α-SMA、FN以及TGF-β/Smad信号通路的蛋白水平降低。敲减TGF-βRⅡ后,上述指标表达同样被抑制。而转染miR-130a-3p抑制物后,上述指标升高。7.miR-130a-3p可以直接靶向TGF-βRⅡ,从而抑制其表达。结论:BLM诱导小鼠PF模型的肺组织中,炎症期发生了巨噬细胞活化、炎症因子分泌增加、NF-κB通路激活和miR-130a-3p的表达上调;纤维化期发生了成纤维细胞增殖与分化、TGF-β/Smad通路激活导致ECM沉积、EMT发生和miR-130a-3p的表达下调。小鼠尾静脉注射miR-130a-3p可以有效缓解BLM诱导的炎症期和纤维化期的肺组织损伤。miR-130a-3p能够通过抑制TNF-α影响NF-κB通路减轻肺脏炎症反应,并且靶向TGF-βRⅡ干预TGF-β/Smad信号通路影响TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖和分化。