【摘 要】
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γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)由于在食品,医药,保健品等领域的重要作用以及传统来源的局限性,近年来逐渐受到国内外学者的广泛关注.诸如接合菌等丝状真菌被认为是生产γ
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γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)由于在食品,医药,保健品等领域的重要作用以及传统来源的局限性,近年来逐渐受到国内外学者的广泛关注.诸如接合菌等丝状真菌被认为是生产γ-亚麻酸潜在重要的商业来源,但仍需了解和掌握其多不饱和脂肪酸的生物合成机制,才能获得产量更高和质量更好的产品.从少根根霉中克隆与GLA生物合成相关的基因,有助于阐明其体内脂肪酸的生物合成途径,并可作为遗传工具进行丝状真菌PUFAs生物合成途径的全面综合研究,为研究真核生物多不饱和脂肪酸代谢提供一个简单模型.与此同时,借助于现代生物工程技术构建GLA高产量性状的基因工程菌株或植株,为大规模的生产应用建立基础.参照真菌来源的△<6>-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR,从少根根霉的总RNA中获得一个593 bp 的cDNA片段,编码197个氨基酸.通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索,表明所扩增片段为新的潜在的△<6>-脂肪酸脱氢酶基因的部分cDNA序列.以酿酒酵母基因工程菌YRAD6和YRAD6-1出发,添加α-亚麻酸(α-Linolenicacid,ALA)作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸(Octadecatetraenoic acid,OTA)的合成;同时添加亚油酸和ALA时,检测到GLA和OTA的合成,而且OTA的含量是GLA含量的3.81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶不仅能催化ALA生成OTA,而且偏好n-3途径中的底物ALA.通过农杆菌介导的遗传转化法,将少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因转入甘蓝型油菜,并处于CaMV35S启动子的调控.经PCR检测、GUS染色、斑点杂交和Southern杂交分析证明,少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到转基因油菜的基因组中,Northem杂交分析表明目的基因在mRNA水平上获得表达.对转基因油菜幼苗叶片进行脂肪酸分析,结果显示叶片中累积了GLA和OTA.将RAD6和RAD6-1导入巴斯德毕赤酵母GS115,用甲醇对转基因酵母进行诱导表达,脂肪酸分析结果表明在两种转基因酵母细胞PICRAD6和PICRAD6-1中均产生GLA和OTA.而且PICRAD6-1中的含量均比PICRAD6中的高,分别从6.51﹪和3.0﹪提高到10.2﹪和4.7﹪,说明在毕赤酵母中的表达也能反映出转译起始密码子周边序列的改变对少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因表达所起的增强作用.与此同时,转基因酵母细胞中还检测到C16:2△<6,9>、C17:2△<6,9>、C18:2△<6,9>的合成,说明少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶的催化功能没有链长的特异性,而只有键位特异性.但从脂肪酸的合成量来说,少根根霉△<6>-脂肪酸脱氢酶偏好于亚油酸和ALA,而且更偏好于ALA.综上所述,该文首次提出将巴斯德毕赤酵母作为一个常规模式表达系统,进行△<6>-脂肪酸脱氢酶基因的综合功能分析.
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