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柑橘是重要水果,提升柑橘果实品质一直是柑橘育种工作最重要的目标之一。研究调控柑橘果实发育的分子机理可以为柑橘分子育种工作奠定坚实的理论基础。参与调控果实发育的调控因子除了为人熟知的转录因子外,还有广泛参与到植物各个阶段生长发育的microRNA(miRNA)。miRNA是20-24nt的小分子RNA,由具有茎环二级结构的MIR基因编码,经过剪切形成成熟体,通过转录后调控机制对靶基因进行调控。本研究通过高通量测序技术全面地鉴定了柑橘miRNA及靶基因,并从测序数据中挖掘了参与调控柑橘果实发育的mi RNA及靶基因。它们分别是miR164-Cs5g10870(NAC转录因子)和miR477a-3p-Cs6g19680(SEP转录因子),随后本研究探索并分析了它们在柑橘果实发育及成熟过程中的生物学功能。此外,本研究还利用组学测序数据在全基因组范围内鉴定了甜橙中潜在的TAS基因及其产生的phasiRNA,分析了mi R3954a及由其靶定Cs1g09600和Cs1g09635触发产生的phasiRNA的功能。具体研究结果如下:1.sRNA组及降解组高通量测序挖掘柑橘miRNA及靶基因本研究以暗柳甜橙(Citrus sinensis),红暗柳甜橙的叶、花和果实,以及紫皮柚(C.grandis)紫色黄皮层、普通柚子黄皮层、红肉琯溪蜜柚红色果肉和普通琯溪蜜柚白色果肉为材料,进行高通量sRNA组学测序及降解组测序。分别以已经公布的红夏橙基因组序列和未公布的晚白柚基因组序列为参考序列,本研究在甜橙中鉴定了183个已知miRNA以及38个新miRNA;在柚子中鉴定了106个已知miRNA以及12个新miRNA。在甜橙叶片中鉴定了107个miRNA的405个靶基因;甜橙花中鉴定了166个miRNA的265个靶基因;甜橙果实中鉴定了118个miRNA的322个靶基因。2.柑橘果实发育成熟相关miRNA及靶基因挖掘及功能分析基于甜橙叶、花以及果实的sRNA组学的数据分析,本研究从中获得了80个甜橙叶片或花或果中高表达miRNA,通过qRT-PCR及northern杂交对这80个miRNA进行验证并筛选出叶片或花或果中显著高表达的miRNA。结果表明,miR482d-5p.2、miRN03及miRN36在甜橙叶片中高表达;miR3954a、miR167b.2、miR5179及miRN08在甜橙花中高表达;miR3951、miR164、miRN31及miR477a-3p在甜橙果实中高表达。本研究通过5’RACE以及烟草瞬时表达体系验证了其中关键miRNA的靶基因。在分析了关键miRNA及靶基因在甜橙果实8个发育时期的表达模式后,本研究发现关键miRNA和相应的靶基因随着果实的发育呈相反的表达模式。其中miR164在甜橙果实发育后期(成熟时期)高表达,而且表达水平有一个稳步的提升。这些实验证据表明miR164可能参与调控甜橙果实的成熟;miR477a-3p和miRN31有着极为类似的表达模式,它们在甜橙花后140天到170天(破色期)的表达量有个骤然地变化,意味着它们很可能在甜橙果肉破色期扮演着调控因子的角色。为验证miR164及miR477a-3p在柑橘果实发育及成熟过程中的功能,本研究构建miR164及其靶基因mimic超表达载体,并将它们转化至早实枳,最终获得1棵miR164超表达阳性植株以及4棵miR164靶基因mimic超表达阳性植株。同样,本研究构建miR477a-3p及其靶基因mimic超表达载体,并将它们转化至山金柑,最终获得5株miR477a-3p超表达阳性植株以及3棵miR477a-3p靶基因mimic超表达阳性植株。由于柑橘外植体转化及再生周期偏长,目前尚未观察到能够指示miR164及miR477a-3p功能的表型。3.甜橙phasiRNA的鉴定及由miR3954a触发产生phasiRNA的功能分析本研究利用甜橙叶、花及果的sRNA组学及降解组学数据,发现在甜橙中有能力触发靶基因产生phasiRNA的mi RNA共有7个,分别是miR167.2、miR2118.1、miR482a-3p、miR482c、mi R827.2、miR3954a和miRN20,这7个miRNA分别触发其靶基因产生共235条phasiRNA,其中包括48条高丰度phasiRNA,这48个phasiRNA在甜橙中共靶定243个靶基因,参与甜橙生长发育中不同的生物学过程。其中miR3954a靶定Cs1g09600和Cs1g09635,共产生8条高丰度的phasiRNA。为验证miR3954a及其触发产生的8条phasiRNA在甜橙发育中的功能,本研究构建了miR3954a及其靶基因mimic超表达载体,并将它们转化至山金柑,最终获得17棵miR3954a超表达阳性植株以及1棵miR3954a靶基因mimic超表达阳性植株。本研究发现mi R3954a超表达子代植株有三个株系显著提早开花。通过进一步实验分析,本研究发现在miR3954a超表达植株中由miR3954a触发产生的phasiRNA同样被超量表达,而这些phasiRNA的30个靶基因均下调表达。这些实验结果暗示miR3954a、由其触发产生8个phasiRNA以及这些phasiRNA靶定的30个靶基因可能构成了复杂的调控网络,共同调控了柑橘的开花。