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背景和目的非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是代谢综合征的肝脏表现,其发病率在全球范围内急剧增加,为目前最常见的慢性肝病。NAFLD的病理变化包括从单纯性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver,NAFL）逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）,以及进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。目前,NAFLD/NASH的主要治疗方法是通过饮食和锻炼等生活方式的改变。临床上尚无获批针对NASH的治疗药物,开发有效潜在治疗药物迫在眉睫。中药应用历史悠久,底蕴深厚,为人类健康护航逾千年,其有效成分或天然产物成为现代疾病药物研发的重要来源,被学者寄予厚望。秦艽,性平,味苦、辛,归胃经、肝经、胆经,具祛风湿、退虚热之功效,应用于风湿关节痛、筋脉拘挛、小儿疳积发热、黄疸等证。现代药理学研究表明秦艽主要环烯醚萜成分龙胆苦苷（Gentiopicroside,GPS）具有利胆、促消化、抗肝毒、抗炎、抗氧化、调节胆汁酸水平等活性,课题组推断其可能具有改善NASH疾病的药理作用。本研究利用非靶向、靶向代谢组学和16SrRNA技术探讨龙胆苦苷对NASH的保护作用。本研究为中草药治疗干预NASH提供理论依据,为天然产物来源开发NASH药物提供思路借鉴,进一步促进中医药传统资源的开发。方法1.NASH小鼠模型建立:应用西方饮食（Western Diet,WD）喂养联合低剂量四氯化碳（CCl4）腹腔注射诱导NASH小鼠模型。将所有小鼠分为5组（n=7）,造模周期为12周。分组如下:（1）对照组（CON）;（2）模型组（MOD）;（3）低剂量GPS组（GPSL,50mg/kg/d）;（4）高剂量GPS组（GPSH,100mg/kg/d）;（5）阳性对照奥贝胆酸组（OCA,10mg/kg/d）。对照组饲喂正常饲料和正常饮用水,其他组给予WD饲料和高糖水。模型组和给药组每周腹腔注射CCl4一次（用橄榄油将CCl4稀释5倍,按1μL/g给药）,对照组腹腔注射同体积溶媒。GPS和OCA采用灌胃给药方式,对照组和模型组接受相同体积的溶媒介质,连续4周给药直到12周实验结束。实验期间,每周定时称量小鼠体重。实验结束前,收集12 h小鼠粪便。结束后,收集小鼠血清、肝脏样本。2.通过对肝组织进行HE、油红和天狼星红染色来验证模型。采用试剂盒测定血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量。3.基于超高效液相色谱-串联飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）平台测定小鼠血清代谢物水平,筛选差异性代谢物,并富集代谢通路。4.基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）平台建立并验证小鼠血清胆汁酸绝对定量的测定方法,解析NASH小鼠体内胆汁酸代谢变化规律以及应用GPS干预后胆汁酸含量的变化。5.小鼠粪便16SrRNA测序分析GPS对肠道菌群丰度及组成的影响。采用Pearson相关性分析探索血清胆汁酸谱与生化指标、肠道菌群的相关性。结果1.成功建立了 NASH小鼠模型。MOD组小鼠肝脏切片可见大量脂质沉积、肝小叶炎症、小叶中央区及汇管区均有纤维条索形成。非酒精性脂肪肝活动评分（NAS）及纤维化评分明显升高,而经过GPS或OCA干预后得到显著改善。在MOD组中观察到血清ALT、AST和TC水平显著升高,通过GPS或OCA治疗后呈现明显下降趋势。2.应用非靶向代谢组学测定小鼠血清代谢物水平,共筛选出差异性代谢物42种,升高的代谢物16种,降低的代谢物26种。富集的差异代谢通路主要有:不饱和脂肪酸的合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,氨酰-tRNA生物合成、苯丙氨酸代谢、初级胆汁酸合成等。3.本研究建立了血清中胆汁酸定量的检测方法,能够同时定量小鼠血清中的23种胆汁酸。该方法专属性、准确度、精密度、提取回收率、稳定性等均符合FDA规定的生物分析方法学要求。GPS可显著降低MOD组升高的胆汁酸水平（α-MCA、β-MCA、ω-MCA、CA和T-β-MCA）,还可降低MOD组小鼠的总胆汁酸、总初级胆汁酸水平,改善NASH小鼠胆汁酸紊乱。4.肠道菌群分析显示模型组与给药组小鼠肠道菌群具有显著差异。与CON组相比,MOD组的厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）（F/B）的比值显著降低。与MOD组相比,GPS治疗后拟杆菌（Bacteroides）、副杆菌（Parabacteroides）和链球菌（Streptococcus）的相对丰度显著降低。Pearson相关性分析结果表明,总初级胆汁酸、总非结合初级胆汁酸、总结合初级胆汁酸和β-MCA与Bacteroides和另枝菌属（Alistipes）的相对丰度呈正相关。总胆汁酸、总次级胆汁酸、总次级结合胆汁酸、CA和大多数次级胆汁酸及其结合形式与布劳特氏菌属（Blautia）和梭菌（Clostridium）的丰度呈负相关。结论1.GPS能够改善NASH小鼠模型的生化指标、肝脂肪变性和肝小叶炎症,具有肝保护作用。2.非靶向代谢组学结果表明NASH发病过程中脂肪酸、氨基酸、胆汁酸等代谢通路紊乱,GPS干预后改善失调代谢物。3.靶向代谢组学结果表明GPS干预后可改善NASH小鼠的血清胆汁酸谱。4.GPS可改善参与胆汁酸代谢相关菌群的相对丰度,推测GPS改善NASH的作用可能与胆汁酸-肠道菌群代谢相关。