背景:人类皮肤是由表皮层、真皮层和皮下组织组成的。皮肤厚度约为1到4毫米,约占了15%的总体重。角质层的厚度约为10到15微米。它位于表皮的最外层,阻止水分丢失以及外来物质入侵。毛囊、皮脂腺和汗腺是特殊化的表皮结构。它们主要位于真皮层和皮下组织,并且和表皮层相连。真皮层由细胞、纤维成分(主要是胶原纤维和弹性纤维),以及大量基质成分组成。表皮和真皮层的交界是表皮-真皮连接。皮肤的组织成分和形态结构均对皮肤正常的功能非常重要。真皮结构的差异性体现在不同的深度(乳头层(浅层真皮);网织层(深层真皮)),以及真皮损伤与否(正常皮肤;瘢痕组织)。胶原纤维和弹性纤维是真皮纤维结缔组织的主要成分,并且与创面愈合、瘢痕形成以及皮肤的生物力学特性密切相关。比如,胶原纤维束的厚度和方向在真皮的浅层和深层,横切面和纵切面,以及在正常真皮和瘢痕组织中均不同。弹性纤维直径在瘢痕组织中明显小于正常皮肤:浅层真皮中为(0.54±0.04μm vs.1.08±0.04μm);深层真皮中为(1.16±0.02μm vs.1.99±0.07μm)。真皮形态结构也会影响皮肤的生物力学性能。但是,据我们所知,真皮结构在毛囊附近和远离毛囊区是否不同尚未见报道。组织工程皮肤是治疗大面积皮肤缺损,提高愈合后美观效果的最有希望的方法之一。组织工程支架的物理特性,如支架组成成分、孔隙率、孔径和孔壁厚度,直接关系到支架的制作方法,并且显著影响营养物质渗透、生物力学性能、生物降解性、细胞增殖和构成。与正常皮肤有相似的组成成分和微观结构的组织工程皮肤有望更能促进创面愈合。因此,进一步了解皮肤微观结构会有利于制作下一代效果更好的组织工程皮肤。在第一部分研究中,我们利用连续组织切片完成了人真皮中胶原纤维和弹性纤维的三维重建,并且定量分析了毛囊和真皮深度对纤维分布的影响。本论文中提到的胶原纤维特指I型胶原纤维。我们还利用micro-CT(micro-computed tomography)测量了人脱细胞真皮ADM(acellular dermal matrix)孔隙率、孔径和孔壁厚度。组织工程支架的结构显著影响组织的性能和接种细胞的活性。目前真皮支架倾向于设计成具有均一孔径的均匀结构。然而,根据我们第一部分研究结果,在不同深度,人真皮纤维空隙和纤维结构都不是均匀的。在第二部分研究中,我们制作了一种含成纤维细胞的、具有不同孔径梯度和三层结构的仿生真皮支架。该支架模仿了人真皮的天然结构(类似于“sandwich”结构):外层具有较大的孔径,中间层具有较小的孔径。组织学实验和westernblotting证实了,该仿生真皮支架通过促进肉芽组织生成和上皮化,进而显著促进了创面愈合。我们的结果提示,该具有梯度孔径和“sandwich”结构的含细胞的仿生真皮支架有望用于组织工程真皮构建。在第三部分研究中,我们试图制作一种能够促进血管化的人工真皮。因为,“sandwich”人工真皮并没有显著促进血管生成。为了解决“sandwich”人工真皮难以促进血管生成的问题,我们创新性的用一个简便的方法,制作了含血管活性肠肽微胶囊的聚己内酯(polycaprolactone,pcl)纳米纤维膜。血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)据报道可促进血管生成。静电纺丝技术制备的纳米纤维膜也可作为理想的创面敷料。根据以上材料的生物学特性,我们首先把多巴胺(dopamine,da)包被在纳米纤维表面,然后利用有强吸附能力的多巴胺吸附血管活性肠肽(vip)。随后,pcl纳米纤维膜浸泡于丙酮中,包裹血管活性肠肽的微胶囊随即在原位生成。我们用高效液相色谱法测量得到了包封率(encapsulationefficiency)是(31.8±2.2)%,载药率(loadingcapacity)是(1.71±0.16)%。多肽释放实验提示血管活性肠肽的释放时间显著延长。激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope)、扫描电镜(scanningelectronmicroscope)以及细胞增殖检测(cellcountingkit-8proliferationassays)显示细胞的粘附和增殖均显著提高。该可控性释放血管活性肠肽的pcl-da-vip纳米纤维膜有望用于创面处理和血管组织再生。目标:该研究的其中一个目的是获得人真皮天然结构信息。另一个目的是,利用获得的天然结构信息,制作仿生人工真皮。第一部分人真皮显微三维结构研究方法:1.通过连续切片、图像配准、图像分割,三维成形和三维可视化重建人真皮显微三维结构;2.通过“分区法”研究真皮不同分区的纤维分布差异;根据距离毛囊远近分区:靠近毛囊区(closetohairfollicles,c-hf)和远离毛囊区(farawayfromhairfollicles,f-hf);根据真皮深度分区:从浅层真皮到深层真皮(从乳头层到网织层);3.通过micro-ct测量人脱细胞真皮(adm)的孔隙率、孔径、孔壁厚度。结果:1.获得了人真皮显微结构三维重建立体图;2.获得人真皮主要成分空间分布规律:弹性纤维在靠近毛囊区明显低于远离毛囊区;胶原纤维和弹性纤维在真皮深层和浅层的含量均明显低于真皮中间层。3.获得人真皮的孔隙率、孔径、孔壁厚度:人真皮的孔隙率是68.3%;平均孔径是131.2μm,中位孔径是95μm;平均孔壁厚度是207.2μm。第二部分基于人真皮显微三维立体图的“sandwich”结构仿生真皮支架的制备,及其在创面愈合中的作用。方法:1.不同孔径胶原支架的制备,支架孔径测量和微观结构观察,支架体外生物降解性能测试;2.单层人工真皮支架的生物学功能实验:体外实验:培养和接种小鼠成纤维细胞;细胞在支架中分布的研究;细胞增殖效率测定。体内实验:含细胞的单层人工支架在体研究。3.三层人工真皮支架的生物学功能实验:体外实验:培养和接种小鼠成纤维细胞,细胞在支架中分布研究,细胞增殖效率测定;体内实验:含细胞的三层人工真皮制备,含细胞的三层人工真皮在体研究,创面愈合测量,h&e染色和masson染色,免疫组织化学研究,westernblotting研究。结果:1.单层人工真皮支架:(1)孔径对于支架体外生物降解的影响:孔径越小,抗胶原酶降解能力越强;(2)孔径对于体外细胞粘附和增殖的影响:较小孔径支架细胞接种效率更高,但是较大孔径更利于细胞增殖;(3)孔径对于体内创面愈合的影响:不同孔径的单层支架对创面愈合未检测到显著差异。2.三层人工真皮支架:(1)三层人工支架对于体外细胞粘附和增殖的影响:较小孔径的三层支架细胞接种效率更高,但是细胞增殖未检测到显著差异。(2)三层人工支架对于体内创面愈合的影响:“sandwich”人工真皮支架显著促进了创面愈合。第三部分可控性释放血管活性肠肽的聚己内酯(pcl-da-vip)纳米纤维膜的制备及其生物学功效的体外实验研究方法:1.聚己内酯(pcl-da-vip)纳米纤维膜的制备和材料特性;通过高效液相色谱仪检测载药率(loadingcapacity(lc))、包封率(encapsulationefficiency(ee))和体外血管活性肠肽释放曲线。2.体外实验:通过细胞增殖检测试剂盒(cck-8),检测pcl-da-vip纳米纤维膜对进体外培养的成纤维细胞增殖的影响。结果:1.聚己内酯(pcl-da-vip)纳米纤维膜的制备和材料特性:(1)随着丙酮处理时间的增加,生成的微胶囊的直径逐渐降低:在用丙酮处理后10分钟、1小时、6小时,分别在纤维膜内部生成了直径为(2.4±0.7)μm,(1.1±0.3)μm和(0.5±0.1)μm的微胶囊;(2)高效液相色谱仪检测到血管活性肠肽的包封率为31.8%,载药率为1.71%;(3)原位产生的血管活性肠肽微胶囊显著延长了vip的释放:未经丙酮处理不含有微球的pcl-da-vip纳米膜,其vip的释放量显著高于其他组。(4)如果不利用多巴胺的强粘附作用,vip难以直接结合到纤维膜表面:带有微球的pcl-vip纳米膜(不经过da的处理,让vip直接粘附在pcl膜),其vip的释放量明显少于其它组。2.体外实验:聚己内酯(pcl-da-vip)纳米纤维膜,显著促进体外细胞增殖:在细胞接种后培养的第7天,pcl-da-vip纳米膜组细胞数量显著高于其他组。结论:本研究中,我们获得了人真皮主要纤维成分(胶原纤维和弹性纤维)的3d重建结构图。根据此结构信息,我们制作了“sandwich”结构的仿生真皮支架并研究其生物学功效。同时针对部分慢性创面血管生成障碍的病理因素,设计制备了可控性释放血管活性肠肽的聚己内酯(pcl-da-vip)纳米纤维膜,并研究其生物学功效。我们获得了以下信息:1、人天然真皮中的纤维分布规律,以及制备仿生真皮支架所需要的部分参数。(1)人真皮中,靠近表皮的部分(浅层)和靠近皮下组织的部分(深层)比真皮中间部分(中层)含有更少的胶原纤维和弹性纤维;(2)胶原纤维和弹性纤维所占人真皮的比例分别是28.96%和8.06%;(3)Micro-CT测量得到的,人真皮的孔隙率是68.3%;平均孔径是131.2μm,中位孔径是95μm;平均孔壁厚度是207.2μm。2、人工真皮支架对细胞生物学行为和创面愈合的影响。(1)不同孔径的单层支架:孔径越小,抗胶原酶降解能力越强;较小孔径(87.7μm)支架细胞接种效率更高,但是较大孔径(166.9μm)更利于细胞增殖;不同孔径(166.9μm,120.4μm,87,7μm)的单层支架对创面愈合未检测到显著差异。(2)不同孔径组合的三层支架:较小孔径的三层支架(87.7/87.7/87.7μm)细胞接种效率更高,但是细胞增殖未检测到显著差异;“Sandwich”仿生结构的三层胶原支架显著促进了创面愈合。3、我们报告了一种创新的简便方法制备含有血管活性肠肽(VIP)微胶囊的聚己内酯(PCL)纳米纤维膜(PCL-DA-VIP);结论显示:可控性释放血管活性肠肽的PCL-DA-VIP纳米纤维膜,显著促进体外细胞增殖。总结:首先,我们获得了人真皮主要纤维成分(胶原纤维和弹性纤维)的3D重建结构图。然后,根据获得的结构信息,制作了“Sandwich”仿生人工真皮。实验证明,模仿天然真皮梯度孔径结构的人工真皮,其生物学效能(细胞增殖、创面愈合等)显著提高。但是,相关机制有待进一步研究。最后,针对“Sandwich”仿生人工真皮的不足之处和慢性创面血管生成障碍的病理特点,我们创新性的制作了可控性释放血管活性肠肽的聚己内酯(PCL-DA-VIP)纳米纤维膜。实验证实,该纳米纤维膜可以实现血管活性肠肽的可控性释放,并且显著性的促进了成纤维细胞体外增殖。在动物实验中,该纳米纤维膜显著促进了创面愈合和血管再生(该部分结果不包含在本论文中)。