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利用基因敲除的实验动物我们可以直接检测疾病病理发生发展的过程,揭示基因、细胞组织结构与病因症状之间的关系。转基因兔已成为基因功能研究、人类疾病模型建立和高价值药用蛋白生产的重要工具。小鼠的Rosa26基因座已被广泛应用于外源基因的定点整合。近年来,关于猪的Rosa26位点也有相关学者进行了研究,并成功培育了转基因猪。小鼠的第11号染色体上存在一个安全位点,在2010年时该位点被斯坦福大学的研究团队成功分离并鉴定出来,命名为hipp11位点,简称H11位点。该位点位于Drg1基因的9号外显子和Eif4enif1基因的19号外显子之间,大小约5kb。由于位于间隔序列中,因此有很高的安全性,不容易被基因沉默,在多种细胞中都可以表达。目的:本研究以家兔为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统,目的是改进兔遗传操作体系,建立成熟高效的兔基因敲除平台,对基因工程兔的推广应用具有重要意义。为基因功能研究、人类疾病动物模型和高价值蛋白乳腺生物反应器研制提供新手段、新方法。方法:⑴利用CRISPR/Cas9基因编辑系统根据家兔的MSTN基因构建敲除载体,在细胞水平验证其敲除效率。⑵通过生物信息学鉴定家兔Rosa26和H11位点,构建Rosa26和H11位点的敲除载体与同源打靶载体。在细胞水平验证敲除效率并构建整合细胞系。⑶比较不同剂量的PMSG的超排效果,选择最佳剂量的PMSG与FSH超排进行比较,选择适合自己实验室的超排方案。结果:⑴设计靶向MSTN基因组gRNA片段2条,构建相应的敲除载体2个。筛选获得1个靶向MSTN基因的CRISPR载体,敲除效率达到20%。⑵在家兔的第21号染色体上鉴定出兔H11位点,构建靶向H11和Rosa6位点相应的敲除载体各2个;分别构建H11和Rosa26的打靶载体;通过荧光观察,药物筛选,结合PCR技术,成功获得H11和Rosa26位点整合Puro基因和ZsGreen1基因的细胞系。⑶实验组中,注射80IU的PMSG的母兔获得的受精卵数最多;适宜的PMSG剂量(80IU/只)与FSH对家兔的超排效果的比较,两者之间差异不显著。选择FSH+HCG为本实验的最佳超排方案。结论:⑴本研究根据CRISPR/Cas9基因编辑技术在细胞水平上创建了一个高效的基因敲除和定点整合系统,为今后转基因兔安全、高效的的制备奠定基础。⑵超排方案的选择,实验组中,注射80IU的PMSG的母兔获得的受精卵数最多;适宜的PMSG剂量(80 IU/只)与FSH对家兔的超排效果的比较,两者之间差异不显著。选择FSH+HCG为本实验的最佳超排方案。建立为成熟的超排体系,为后续制备转基因兔奠定基础。