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肝纤维化被认为是各种慢性肝病导致的肝细胞弥漫性损伤的一种病理过程，其特征是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的积累。肝星状细胞(HSC)的活化是被认为是肝纤维化的重要一步，并导致肝纤维化获得多种功能，包括收缩，趋化性，和矩阵重塑。HSC活化是肝纤维化发生发展进程中最重要的环节。通常，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和衰老是阻断HSC活化的潜在治疗方法。
研究发现microRNA(miRNA)在多种纤维化疾病过程中的具有调控作用。MiRNA能调控多种肝纤维化的相关因子的表达，反过来，肝纤维化又能导致多种miRNA表达发生改变。之前，本课题组已证实miR-145与肝纤维化发生与发展密切相关，但是miR-145在肝星状细胞衰老过程中的作用鲜有报道，这需要进一步的研究。
本实验探讨了miR-145在肝纤维化发生过程中表达情况，并进一步研究miR-145对活化HSC衰老影响以及其中的分子机制。研究内容如下：
(1)miR-145，ZEB2和p53在肝纤维化过程中的表达检测
在体内，采用腹腔注射四氯化碳(carbon tetrachloride , CCl4)6周建立C57小鼠肝纤维化模型，取肝纤维化组织进行HE，Masson和天狼星红染色，同时检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)和I型胶原(Collagen type1, Col. I)的蛋白表达对纤维化模型进行鉴定。此外，采用qPCR和Westernblot技术检测肝纤维化组织和原代HSCs中miR-145，ZEB2和p53mRNA和蛋白表达，采用免疫荧光双染技术观察ZEB2和p53是否表达于活化HSCs中。体外我们使用TGF-β1(10ng/ml)浓度对大鼠肝星状细胞HSC-T6和人肝星状细胞LX-2刺激24h，然后检测ZEB2，miR-145和p53的表达变化。结果发现在CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝组织和原代HSC中以及体外TGF-β1处理的HSC中，miR-145和p53的表达均是降低的，而ZEB2表达水平升高。
(2)miR-145对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2中，采用miR-145mimics和inhibitor建立过表达和沉默miR-145细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ，24h)进行刺激，紧接着采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测相关衰老蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：过表达miR-145能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；沉默miR-145，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(3)ZEB2对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2细胞中，采用ZEB2小干扰RNA(ZEB2 siRNA)和ZEB2质粒(ZEB2 plasmid)建立沉默ZEB2和过表达ZEB2细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ， 24h)进行刺激，采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测衰老相关蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：沉默ZEB2能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；过表达ZEB2，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(4)p53对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2细胞中，采用p53小干扰RNA(p53 siRNA)和p53质粒(p53 plasmid)建立沉默p53和过表达p53细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ，24h)进行刺激，采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测衰老相关蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：过表达p53能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；沉默p53，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(5)miR-145与ZEB2的靶向性研究
生物信息学软件分析结果显示，miR-145同ZEB2之间可能具有一定的靶向关系。在LX-2细胞中，我们分别采用miR-145inhibitor和mimics建立沉默与过表达的细胞模型。紧接着采用qPCR与Westernblot检测ZEB2mRNA与蛋白的表达变化。结果提示：过表达的miR-145可以使ZEB2mRNA与蛋白水平表达降低，相反的，沉默miR-145可以使ZEB2mRNA和蛋白水平升高。此外，进一步，本课题组采用双荧光素酶报告基因实验确认两者的靶向关系。结果显示，共转染miR-145mimics与ZEB2的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效抑制LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。
(6)ZEB2对p53启动子的影响
在LX-2细胞中，我们分别采用ZEB2siRNA和plasmid建立沉默与过表达的细胞模型。紧接着采用qPCR与Westernblot检测p53mRNA与蛋白的表达变化。结果提示：过表达的ZEB2可以使p53mRNA与蛋白水平表达降低，相反的，沉默ZEB2可以使p53mRNA和蛋白水平升高。此外，进一步，本课题组采用双荧光素酶报告基因实验确认两者的关系。结果显示，共转染ZEB2plasmid与p53的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效抑制LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。共转染ZEB2siRNA与p53的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效促进LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。
上述结果提示，miR-145可能通过靶向ZEB2来调控p53通路进而影响LX-2细胞的衰老。
研究发现microRNA(miRNA)在多种纤维化疾病过程中的具有调控作用。MiRNA能调控多种肝纤维化的相关因子的表达，反过来，肝纤维化又能导致多种miRNA表达发生改变。之前，本课题组已证实miR-145与肝纤维化发生与发展密切相关，但是miR-145在肝星状细胞衰老过程中的作用鲜有报道，这需要进一步的研究。
本实验探讨了miR-145在肝纤维化发生过程中表达情况，并进一步研究miR-145对活化HSC衰老影响以及其中的分子机制。研究内容如下：
(1)miR-145，ZEB2和p53在肝纤维化过程中的表达检测
在体内，采用腹腔注射四氯化碳(carbon tetrachloride , CCl4)6周建立C57小鼠肝纤维化模型，取肝纤维化组织进行HE，Masson和天狼星红染色，同时检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)和I型胶原(Collagen type1, Col. I)的蛋白表达对纤维化模型进行鉴定。此外，采用qPCR和Westernblot技术检测肝纤维化组织和原代HSCs中miR-145，ZEB2和p53mRNA和蛋白表达，采用免疫荧光双染技术观察ZEB2和p53是否表达于活化HSCs中。体外我们使用TGF-β1(10ng/ml)浓度对大鼠肝星状细胞HSC-T6和人肝星状细胞LX-2刺激24h，然后检测ZEB2，miR-145和p53的表达变化。结果发现在CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝组织和原代HSC中以及体外TGF-β1处理的HSC中，miR-145和p53的表达均是降低的，而ZEB2表达水平升高。
(2)miR-145对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2中，采用miR-145mimics和inhibitor建立过表达和沉默miR-145细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ，24h)进行刺激，紧接着采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测相关衰老蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：过表达miR-145能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；沉默miR-145，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(3)ZEB2对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2细胞中，采用ZEB2小干扰RNA(ZEB2 siRNA)和ZEB2质粒(ZEB2 plasmid)建立沉默ZEB2和过表达ZEB2细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ， 24h)进行刺激，采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测衰老相关蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：沉默ZEB2能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；过表达ZEB2，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(4)p53对TGF-β1诱导的活化LX-2细胞衰老的影响
在LX-2细胞中，采用p53小干扰RNA(p53 siRNA)和p53质粒(p53 plasmid)建立沉默p53和过表达p53细胞模型，同时采用TGF-β1(10ng/ml ，24h)进行刺激，采用流式细胞术，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况以及Westernblot检测衰老相关蛋白和Col.I和α-SMA的蛋白表达情况。结果提示：过表达p53能促进活化LX-2的衰老，同时抑制Col.I和α-SMA的蛋白表达；沉默p53，使TGF-β1诱导的LX-2衰老减少，同时Col.I和α-SMA的蛋白表达水平进一步升高。
(5)miR-145与ZEB2的靶向性研究
生物信息学软件分析结果显示，miR-145同ZEB2之间可能具有一定的靶向关系。在LX-2细胞中，我们分别采用miR-145inhibitor和mimics建立沉默与过表达的细胞模型。紧接着采用qPCR与Westernblot检测ZEB2mRNA与蛋白的表达变化。结果提示：过表达的miR-145可以使ZEB2mRNA与蛋白水平表达降低，相反的，沉默miR-145可以使ZEB2mRNA和蛋白水平升高。此外，进一步，本课题组采用双荧光素酶报告基因实验确认两者的靶向关系。结果显示，共转染miR-145mimics与ZEB2的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效抑制LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。
(6)ZEB2对p53启动子的影响
在LX-2细胞中，我们分别采用ZEB2siRNA和plasmid建立沉默与过表达的细胞模型。紧接着采用qPCR与Westernblot检测p53mRNA与蛋白的表达变化。结果提示：过表达的ZEB2可以使p53mRNA与蛋白水平表达降低，相反的，沉默ZEB2可以使p53mRNA和蛋白水平升高。此外，进一步，本课题组采用双荧光素酶报告基因实验确认两者的关系。结果显示，共转染ZEB2plasmid与p53的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效抑制LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。共转染ZEB2siRNA与p53的3’端非编码区(3’ untranslated region, 3’-UTR)质粒，可以有效促进LX-2细胞中ZEB23’-UTR的相对荧光值表达。
上述结果提示，miR-145可能通过靶向ZEB2来调控p53通路进而影响LX-2细胞的衰老。