透明质酸酶通过降解皮肤组织或者肿瘤微环境中的透明质酸,提高组织的通透性从而有利于药物扩散,在皮下给药以及肿瘤治疗中均有很好的应用前景。但是在皮下给药中,联合透明质酸酶给药之后,大分子药物的生物利用度仍与静脉给药存在较大差距,原因在于天然透明质酸酶无法在皮下长效发挥作用。另一方面在肿瘤治疗的应用中,天然透明质酸酶因其体内循环半衰期短严重影响了药效的发挥。因此,本论文针对透明质酸酶这两大应用领域存在的问题,采用基因工程技术构建重组长效透明质酸酶,以期提升大分子皮下给药的生物利用度以及实现对体内肿瘤的药效提升效果。论文具体开展的研究工作如下：1.重组透明质酸酶分子构建及高表达克隆的筛选。采用分子克隆技术成功构建Igκ-rhPH20、Igκ-rhPH20-HSA与Igκ-rhPH20-Fc的融合基因,DNA片段大小分别为1438 bpV、2012 bp与2077 bp;整合到表达载体之后将其成功转染到宿主细胞中,筛选克隆并进行表达量的比较：对于不同宿主细胞,CHO KSD细胞获得克隆的平均表达水平(18U/24h·mL)高于CHOS细胞(12U/24h·mL);另外,构建带有IRES-eGFP的双顺反子表达载体,成功根据荧光强度通过流式分选术筛选高表达克隆,该法高效快速,获得克隆稳定性好：并且考察了载体结构对蛋白表达量的影响,载体GC含量高,DNA对转录因子开放,蛋白表达量上调。2.透明质酸酶重组细胞培养并进行蛋白纯化。对三种重组透明质酸酶rhPH20、 rhPH20-Fc以及rhPH20-HSA的克隆40 mL批次培养基础表达量为402 U/mL、596 U/mL以及737 U/mL。在5 L激流式生物反应式实现了培养工艺的优化及放大。确定了不同蛋白的层析柱选择以及层析条件,获得不同蛋白分子量分别为,61 kDa(rhPH20),79 kDa (rhPH20-HSA)以及190 kDa (rhPH20-Fc)。比较三种重组蛋白比活性：rhPH20为106,724 U/mL; rhPH20-HSA为10,256U/mL,维持原来10%左右的活性,rhPH20-Fc为40,124 U/mL,能维持原来40%的活性。优化了蛋白冻干制剂配方,能够维持较好的赋型效果以及蛋白稳定性。3.以裸鼠为实验对象,考察重组透明质酸酶rhPH20-HSA及rhPH20-Fc的皮下作用效果考察以及联合给药对药代动力学的影响。不同的来源的透明质酸酶,包括牛源蛋白以及人源的天然蛋白与融合蛋白,在同等活性单位条件下,短时间(≤45 min)内对台盼蓝皮下扩散的促进效果差别不大,并且透明质酸酶对染料的促进扩散作用呈现剂量依赖性。而在皮下结构重建方面,重组透明质酸酶rhPH20与提纯的透明质酸酶产品在24h内皮肤结构恢复,rhPH20-Fc与rhPH20-HSA在小鼠皮下更稳定,造成皮下空洞恢复时间由延长到85～120h,成功实现了皮下长效。透明质酸酶与蛋白药物联合给药,均能够增加AUC,增大Cmax,并且Tmax提前。对于Stelara, rhPH20-Fc将其生物利用度由rhPH20组的85.9%提升到93.1%;对于250 kDa的TFI大分子,rhPH20联用生物利用度提升至63.8%,而与长效rhPH20-Fc联用生物利用度提升至96.6%,接近静脉给药。4.比较性研究了透明质酸酶对不同尺寸肿瘤治疗药物的促进扩散作用以及药效提升效果。选取三种不同尺寸的典型抗肿瘤药物：大小约为1.5×1.0×0.7nm的小分子化疗药物阿霉素(Dox)、直径约10～15nm的曲妥珠单抗(Tmab)以及长120nm×宽35 nm的热疗药物金纳米棒(GNR)。透明质酸酶(rhPH20和rhPH20-Fc)对二维细胞水平药物量效关系没有影响,仅在胞外基质以及肿瘤微环境存在的三维细胞培养水平对三种药物的扩散、蓄积及生长抑制表现出不同程度的促进作用。其中对抗体扩散的增幅最大,其扩散系数从4.47×10-4μm2/s分别增大到1.72×10-3μm2/s和1.69×10-3μm2/s。重组透明质酸酶rhPH20-Fc在体内比原始rhPH20更稳定,rhPH20的循环半衰期仅为2.3 min,融合透明质酸酶rhPH20-Fc的循环半衰期提升至2.8 h,是原始蛋白的73倍,大幅提升血液循环时间能够增加透明质酸酶在肿瘤组织的截留。rhPH20-Fc促进瘤内药物扩散,利于药物在瘤内的蓄积,并且增强了化疗药物对肿瘤生长的抑制作用,针对三种药物不同治疗效果进行定量分析,发现对抗体分子的辅助治疗效果最好。