【摘 要】
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[目 的]探讨RDX蛋白能否作为预测肺腺癌患者术后发生复发转移的生物标志物,并进一步验证其对肺腺癌细胞生物学行为的影响。[方法]1、收集经手术确诊的病灶＜3cm,并且术后2年内发生及未发生复发转移的中分化浸润性的原发性肺腺癌组织,利用胰酶酶解的方法提取肺癌组织及淋巴结组织中的蛋白质,通过TMT标记的方法进行蛋白质组测序,以P＜0.05,差异表达量变化大于1.5倍,筛选显著差异表达蛋白,并利用生物信
【基金项目】
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云南省高层次人才培养支持计划“名医专项”（2080199）； 癌症生存者延续护理服务需求调查研究2019FE001（-243）； 云南省李印专家工作站（202005AF150044）；
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[目 的]探讨RDX蛋白能否作为预测肺腺癌患者术后发生复发转移的生物标志物,并进一步验证其对肺腺癌细胞生物学行为的影响。[方法]1、收集经手术确诊的病灶＜3cm,并且术后2年内发生及未发生复发转移的中分化浸润性的原发性肺腺癌组织,利用胰酶酶解的方法提取肺癌组织及淋巴结组织中的蛋白质,通过TMT标记的方法进行蛋白质组测序,以P＜0.05,差异表达量变化大于1.5倍,筛选显著差异表达蛋白,并利用生物信息学软件进行差异蛋白质注释、亚细胞定位、差异蛋白筛选、GO富集、蛋白质互作网络等分析筛选目标蛋白RDX。2、收集23对有、无复发转移肺腺癌组织标本,用免疫组织化学技术分析比较组织中的RDX蛋白表达水平。3、利用Wester blot和RT-QPCR方法比较A549、H1299、H383、H1734中RDX表达水平,筛选出高表达的肺腺癌细胞株,4、将RDX表达水平较高的细胞株敲低RDX基因。5、通过MTT和平板克隆形成实验检测RDX敲低对肺腺癌细胞增殖能力的影响;利用Transwell实验评估RDX敲低对肺腺癌细胞侵袭能力的影响;通过划痕实验观察RDX敲低对肺腺癌细胞迁移能力的影响。6、Western blot检测敲低RDX的表达对上皮间质转化标志物E-cadherin、vimentin及侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9表达的影响。[结 果]1、通过对术后有无复发转移的肺腺癌组织行非标（Label-free）蛋白质组定量技术检测,共鉴定出5个差异显著的蛋白质,其中与无复发转移的肺腺癌组织相比,BRI3 binding protein、Exocyst complex component 4、NIMA related kinase 7蛋白质在有复发转移的肺腺癌组织中表达下调,Radixin、Insulin like growth factor 2 receptor蛋白质在有复发转移的肺腺癌组织中表达上调。RDX的亚细胞定位:细胞核。2、RDX在术后两年内出现复发转移的肺腺癌组织、未出现复发转移的肺腺癌组织中的阳性表达率分别为69.6%（16/23）、30.4%（7/23）,有统计学差异（P＜0.05）。3、mRNA和蛋白层面上分别检测各肺腺癌细胞系RDX的表达结果显示:A549和H1299中RDX表达水平均高于较H383、H1734及BEAS-2B,选择A549和H1299细胞作为后续研究的细胞株。4、免疫荧光方法检测RDX shRNA慢病毒感染的A549和H1299两株肺癌细胞,并利用Western blot检测感染效果,结果显示,A549和H1299细胞shRDX组中RDX蛋白的相对表达水平均较shNC降低（P＜0.05）。5、体外细胞生物学功能结果显示:与第0天相比,shRDX组A549细胞和H1299细胞的增殖速度在第3天和5天与shNC组相比降低（P＜0.05）;与shNC组相比,shRDX组A549细胞和H1299细胞的克隆形成能力明显减弱（P＜0.001）;shRDX组H1299和A549细胞穿过Transwell小室的细胞数明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）,划痕时细胞的迁移速度明显减弱,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞侵袭迁移能力下降。6、Western blot检测结果显示:敲低RDX上调肺腺癌细胞E-cadherin的表达,下调vimentin、MMP2、MMP9的表达,表示抑制RDX的表达可以抑制上皮间质转化并伴随MMP2、MMP9的表达下调。[结 论]1、RDX在术后发生复发转移的肺腺癌组织中的表达较未发生复发转移的组织升高,说明RDX可能是影响肺腺癌患者复发转移的重要蛋白,有可能作为临床上潜在的监测靶点。2、RDX可能通过调控E-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9表达来影响肺腺癌细胞侵袭转移,RDX也可促进肺腺癌细胞增殖、克隆形成的能力,发挥促癌作用,表明RDX有望成为辅助评估肺腺癌患者预后的生物标志物。
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