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背景我国心血管病防治已见成效,但仍面临严峻挑战。每年因心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)死亡的人数占疾病总死亡人数的40%以上,成为影响居民生活的首要疾病。近年调查提示,这种死亡多由冠心病引发的心律失常导致,尤以急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后发生恶性室性心律失常最为常见。研究显示交感神经重构在心律失常的发生中起着重要作用。心肌梗死后,伴随着大量炎症反应的发生,大量巨噬细胞聚集在受损心肌,分泌的炎性因子进一步激活下游通路,引发神经的修复与再生,从而导致交感神经重构的发生。在这个过程中有一个关键的炎性因子神经生长因子(Nerve growth factor,NGF),作为神经营养因子的一员,NGF能够增强新生交感神经的分化与发育,促进交感神经损伤后的修复反应,是心肌梗死后参与神经修复的重要因子之一。益气活血方由黄芪、人参、川芎、当归、三七五味药组成,是导师临床治疗胸痹的经验用方,临床上在改善心肌缺血、心律失常方面有着很好的疗效。前期研究显示益气活血方可以一定程度改善心肌梗死后伴发的炎症反应,下调炎性因子,NGF作为交感神经重构中的关键炎性因子,或可成为益气活血方抑制交感神经重构的重要靶点。目的通过研究益气活血方对巨噬细胞,NGF,和下游相关受体的影响,探讨益气活血方调控神经重构的分子机制。方法选取健康SD大鼠,采用经典心肌梗死模型,结扎大鼠冠状动脉前降支进行造模。将造模成功的大鼠依照心电图随机分为三组,分别为模型组、益气活血组和美托洛尔对照组,另设假手术组作为对照组。假手术只对心包膜进行穿线,不进行结扎。各组于术后24h开始分别灌胃相应药物,对照组灌胃蒸馏水,每日1次。以术后3天、7天、28天作为观察时间点,取材前先进性小动物超声检查,检测大鼠左心室射血分数(Left ventricular ej ection fraction,LVEF),左室短轴率(Left ventricular fractional shortening,LVFS),左室舒张末期内径(Left ventricular end diastolic diameter,LVIDd)和左室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic diameter,LVIDs)。取心脏组织,一部分用4%甲醛固定液固定,进行病理苏木精-伊红染色法检测(Hematoxylin-eosin staining method,HE染色)和免疫组化检测(Immunohistochemical,IHC),观察大鼠病理改变,以及感神经再生情况,观察计数巨噬细胞CD68以及NGF的阳性表达,并对CD68和NGF进行免疫荧光双染,观察两者的共定位情况。另一部分放冻存管冻存,进行免疫蛋白印迹法检测(Western-Blot,WB),检测心肌梗死边缘区NGF、原肌球蛋白受体激酶A(Tropomyosin receptor kinase A,TrkA)、磷酸化原肌球蛋白受体激酶A(Phosphorylation tropomyosin receptor kinase A,TrkA)、p75神经营养因子受体(P75neurotrophic factor receptor,p75NTR)的蛋白表达。结果实验一,益气活血方对心肌梗死大鼠心功能及神经重构的影响评价超声情况:各时间点模型组与假手术组相比,LVEF、LVFS均低于假手术(P<0.01);LVIDd、LVIDs大于假手术组(P<0.01)。用药3天后,与模型组相比,美托洛尔组LVEF,LVFS均有所升高(P<0.05,P<0.01),益气活血组LVEF、LVFS差异均无统计学意义(P>0.05);两用药组LVIDd、LVIDs值均有所降低但无统计学意义(P>0.05)。用药7天,两用药组LVEF,LVFS较模型组有所增高,美托洛尔组LVEF,LVFS差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),益气活血组LVEF差异有统计学意义(P<0.05)、LVFS差异无统计学意义(P>0.05);两用药组与模型组相比,LVIDd、LVIDs值均有所降低,美托洛尔组LVIDd、LVIDs差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05),益气活血组LVIDd差异有统计学意义(P<0.05),LVIDs差异无统计学意义(P>0.05)。用药28天,与模型组相比,两用药组LVEF,LVFS均有增高,美托洛尔组(P<0.01,P<0.01),益气活血组(P<0.01,P<0.05);两用药组与模型组相比,LVIDd、LVIDs值均有所降低,美托洛尔组LVIDd、LVIDs差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.05),益气活血组LVIDd、LVIDs差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。两用药组之间没有明显差异。用药组心功能及心室结构均有改善。病理改变:3、7、28天三个时间点,假手术组大鼠心肌梗死周围心肌细胞排列整齐,方向、大小基本一致,有极少量炎性细胞浸润;模型组极少见正常心肌细胞,排列紊乱,大小不等,方向错乱,间质宽大,有大量炎性细胞浸润;益气活血及美托洛尔用药组心肌细胞排列较模型组整齐,炎性细胞浸润有所减少。模型组可见梗死及边缘区心肌结构破坏严重,炎症细胞聚集,用药组28天较3天、7天恢复好。交感神经纤维TH:术后3天假手术组视野可见极少量阳性神经纤维分布,模型组视野可见大量阳性神经纤维分布,且分布混乱,密度明显高于假手术组(P<0.01);益气活血组及美托洛尔组可见较少量阳性神经纤维分布,且分布均匀,基本与心肌细胞方向一致,密度较模型组有明显降低(P<0.01)。术后7天,假手术组视野可见极少量阳性神经纤维分布,模型组视野可见大量阳性神经纤维分布,且分布混乱,密度明显高于假手术组(P<0.01);益气活血组及美托洛尔组可见较少量阳性神经纤维分布,且分布均匀,基本与心肌细胞方向一致,纤维的密度较模型组有明显降低(P<0.01)。术后28天,假手术组视野可见少量阳性神经纤维分布,模型组视野可见大量阳性神经纤维分布,且分布混乱,密度明显高于假手术组(P<0.01);益气活血组及美托洛尔组可见视野中可见较少量整齐分布阳性神经纤维,较7天组多,纤维的密度较模型组有明显降低(P<0.01)。本实验可以明确观察到心脏整体功能的改变以及相应的病理变化,益气活血方改善作用明显。实验二,益气活血方对炎症反应相关细胞因子的影响免疫组化CD68表达:3、7、28天三个时间点模型组大鼠梗死心机周围组织的CD68阳性表达量比假手术组明显增多(P<0.01)。与模型组相比,美托洛尔和益气活血两用药组CD68阳性表达量均有减少(P<0.01),两组组间差异不明显。免疫组化NGF表达:3、7、28三个时间点模型组大鼠梗死心肌周围组织NGF的阳性表达量显比假手术组多(P<0.01)。与模型组相比,三个时间点益气活血和美托洛尔用药组NGF表达量均有减少(P<0.01),两组组间差异不明显。3天时,益气活血组差异较模型组没有统计学意义(P>0.05),美托洛尔组差异较模型组有统计学意义(P<0.01);7天、28天益气活血和美托洛尔量用药组NGF 阳性表达均有减少,且具有明显统计学意义(P<0.01)。荧光共定位:CD68阳性显示红色荧光,NGF阳性显示绿色荧光,双重阳性呈现黄色荧光,细胞核显示蓝色荧光。结果显示3、7、28天三个时间点模型组几乎所有NGF表达在巨噬细胞上,即说明心肌梗死后,心肌梗死边缘区增长的NGF是由巨噬细胞表达产生的,经过美托洛尔和益气活血方治疗,两用药组NGF在巨噬细胞上的表达有所减少。本实验可以观察到心肌梗死后巨噬细胞明显增多,且聚集在受损区域,NGF的表达量随CD68的增多而增多。益气活血方对巨噬细胞的分泌聚集有一定的抑制作用,同时还可以减少巨噬细胞NGF的分泌。实验三,益气活血方对NGF及其受体的影响WB检测NGF表达:三个时间点模型组大鼠梗死周围NGF蛋白表达均明显高于假手术组(P<0.01);术后3天,观察各组大鼠NGF的蛋白表达情况,结果显示:模型组大鼠梗死周围NGF蛋白表达均明显高于假手术组(P<0.01);术后3天,美托洛尔组、益气活血组两用药组的NGF蛋白表达较模型组均有降低趋势,但没有统计学意义(P>0.05);两组组间没有明显差异。术后7天,美托洛尔组的NGF蛋白表达较模型组均有所降低(P<0.01);益气活血组的NGF蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.01)。术后28天,美托洛尔组的NGF蛋白表达较模型组均明显降低(P<0.01);益气活血组的NGF蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.01);组间没有明显差异。WB检测TrkA、p-TrkA表达:观察各组大鼠TrkA的蛋白表达情况,结果显示:术后3天,美托洛尔组的TrkA、p-TrkA蛋白表达较模型组均有所降低,且具有统计学意义(P<0.05);益气活血组的p-TrkA蛋白表达量较模型组有差异(P<0.01),TrkA蛋白表达较模型组也有所下降,但较模型组没有统计学意义;术后7天,两用药组的TrkA、p-TrkA蛋白表达较模型组均有所降低(P<0.01);组间没有明显差异。术后28天,美托洛尔组的TrkA、p-TrkA蛋白表达较模型组有所降低,且具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);益气活血组的TrkA、p-TrkA蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.05,P<0.01);两用药组组间没有明显差异。WB检测P75NTR表达:模型组大鼠梗死周围p75NTR蛋白表达均明显高于假手术组(P<0.01);术后3天,美托洛尔组的p75NTR蛋白表达较模型组均有所降低,且具有统计学意义(P<0.01);益气活血组的p75NTR蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.01);术后7天,美托洛尔组的p75NTR蛋白表达较模型组均有所降低,且具有统计学意义(P<0.01);益气活血组的p75NTR蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.05);组间没有明显差异。术后28天,两用药组的p75NTR蛋白表达较模型组均明显降低(P<0.01);益气活血组的p75NTR蛋白表达较模型组也均有所下降(P<0.01);组间没有明显差异。结论1.益气活血药能够通过改善心功能,改善心肌缺血状况,从而控制神经重构的发生。2.益气活血药能够作用巨噬细胞抑制炎症反应的发生,减少巨噬细胞在心肌梗死周围区的聚集,并且能够通过抑制巨噬细胞合成分泌NGF,从而调节NGF的分泌。3.益气活血药能够有效降低NGF的表达,并且抑制其受体TrkA的磷酸化,从而减少其受体的激活,避免下游通路的激活,有效抑制神经重构。