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钩端螺旋体（简称钩体）病是由问号钩体引起的人兽共患病,在全世界范围内流行,问号钩体侵入人体后能引起急性发热和全身各系统的疾病。钩体病的主要宿主之一是鼠类动物,对鼠类不致病,且新近发现,问号钩体在小鼠巨噬细胞内被杀灭,而在人巨噬细胞内存活并繁殖,但机理不清楚。在钩体病感染早期,活性氧中间产物（reactive oxygen intermediates,ROIS）和活性氮中间产物（reactive nierogen intermediates,RNIS）途径是巨噬细胞细胞杀伤抑制细菌的经典途径。本研究以不同宿主巨噬细胞吞噬问号钩体后的杀菌途径及机制为切入点,采用问号钩体（黄疸出血群赖型赖株,国内编号:56601）感染人或小鼠单核-巨噬细胞为模型,了解人和小鼠巨噬细胞吞噬问号钩体后ROIS、RNIS途径活化及其在杀灭问号钩体中的作用与差异,确定上述杀菌途径功能状态与问号钩体在不同宿主来源巨噬细胞中被杀灭或生存繁殖的关系及分子机制。具体研究内容如下:1.ROIS系统对问号钩体在人和小鼠巨噬细胞内存亡的影响（1）巨噬细胞NADPH氧化酶活性检测:用光度法结合还原型辅酶Ⅱ（NADPH）阻断实验检测对照组、问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组2h、4h、12h和24h小鼠单核-巨噬样细胞株（J774A.1）和人单核细胞株（THP-1）的NADPH氧化酶活性。结果显示问号钩体感染J774A.1细胞2h、4h、12h和24h后NADPH氧化酶活性由对照组的0.6190μmol/min/mg分别上调了2.48、9.92、5.16和4.29倍（P<0.05）,阻断组的NADPH氧化酶活性是感染组相同时间段的0.20、0.41、0.09和0.21倍,阻断剂处理后问号钩体感染细胞NADPH酶活性显著下降（P<0.05）;问号钩体感染THP-1细胞后,NADPH氧化酶活性由对照组的0.7235μmol/min/mg上调了1.22、6.09、2.06和1.33倍（P<0.05）;阻断组是感染组的0.45、0.38、0.76和0.58倍（P<0.05）,阻断剂处理后钩体感染细胞NADPH酶活性显著下降（P<0.05）;（2）巨噬细胞ROS水平检测:用特异性荧光探针DCFH-DA标记ROS,结合荧光显微镜检测对照组、问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞ROS水平。结果表明,问号钩体感染的J774A.1细胞ROS特异荧光亮度较未感染细胞逐渐增强,4h时达到最强;阻断组各时间段细胞荧光亮度相对感染组明显变弱,阻断效果明显;而THP-1细胞感染组各时间段ROS荧光亮度变化和阻断效果均不明显;（3）巨噬细胞超氧离子含量检测:用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）还原法检测对照组、问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞内超氧离子水平。结果显示,问号钩体感染J774A.1细胞后OD450nm值由对照组的0.1890上调了1.88、1.79、1.90和1.79倍,钩体感染后细胞超氧离子水平显著上调（P<0.05）,阻断组结果是感染组相同时间段的0.67、0.88、0.90和0.90倍,阻断后钩体感染细胞超氧离子水平显著下调（P<0.05）;问号钩体感染THP-1细胞后OD450nm值由对照组的0.1237上调了2.05、2.16、2.19和2.48倍,钩体感染后细胞超氧离子水平显著上调（P<0.05）,阻断组结果是感染组相同时间段的0.59、0.93、1.00和0.89倍,阻断后钩体感染细胞超氧离子水平显著下调（P<0.05）;（4）巨噬细胞内吞噬泡、问号钩体形态、数量与分布观察:用透射电子显微镜观察问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组4h、12h和24h的J774A.1和THP-1细胞内吞噬泡膜、问号钩体形态、数量与分布情况。观察结果显示,问号钩体在J774A.1细胞内被吞噬泡膜包围,随着感染时间的延长,细胞内问号钩体数量下降,且问号钩体典型形态变得不完整,但在经NADPH阻断剂处理后问号钩体在J774A.1细胞内被吞噬泡膜包围的现象明显减少,随着感染时间的增加,细胞内问号钩体数量有所增加,且问号钩体保持完整典型形态。而大多数问号钩体在NADPH阻断剂处理前后的THP-1细胞内均游离在细胞浆内,随着感染时间的延长,细胞内问号钩体数量均有增多,且均保持完整典型形态。（5）胞内问号钩体与溶酶体LAMP-1的共定位情况观察:采用特异荧光抗体染色后激光共聚焦显微镜观察问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组4h、12h和24h的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体与细胞溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）的共定位情况。观察结果显示,J774A.1细胞内问号钩体与LAMP-1的共定位随感染时间的延长而增加,胞内问号钩体特异荧光逐渐变少,但经NADPH阻断剂处理后问号钩体与LAMP-1的共定位随感染时间延长而明显减少。THP-1细胞内问号钩体与溶酶体膜标志LAMP-1共定位随时间的感染时间的延长减少,胞内问号钩体特异荧光逐渐增多,NADPH阻断剂对问号钩体与THP-1细胞溶酶体膜LAMP-1的共定位没有明显影响。（6）巨噬细胞内问号钩体活性检测:用流式细胞术检测对照组、问号钩体感染组和NADPH阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体活性。结果显示,问号钩体感染J774A.1细胞后,细胞内问号钩体活性由对数生长期问号钩体的97.03%,降低到61.45%、42.53%、33.38%和30.23%,感染后胞内钩体活性显著下降（P<0.05）,阻断组是感染组同时间段的1.17、1.67、1.93和2.36倍,阻断后胞内钩体活性与感染组比显著上调（P<0.05）。THP-1细胞感染问号钩体后,胞内问号钩体活性从对数生长期问号钩体的96.87%降低到76.98%、66.63%、60.05%和73.66%,感染后胞内钩体活性显著下降（P<0.05）,阻断组是感染组的0.89、1.00、1.02和0.98倍,阻断效果不显著。2.RNIS系统对问号钩体在人和小鼠巨噬细胞内存亡的影响（1）巨噬细胞i NOS基因m RNA水平检测:以GAPDH为内参,用实时荧光定量PCR检测对照组和问号钩体感染组不同时间段J774A.1和THP-1细胞i NOS基因m RNA水平。结果表明,问号钩体感染J774A.1细胞后,i NOS基因m RNA表达水平较对照组分别上调1.37、2.82、25.76和27.47倍（P<0.05）,感染后i NOS基因m RNA表达水平显著上调;问号钩体感染THP-1细胞后i NOS m RNA表达水平较对照组上调1.59、3.98、3.89和8.81倍（P<0.05）,感染后i NOS基因m RNA表达水平显著上调。（2）巨噬细胞i NOS蛋白水平检测:结合i NOS阻断实验,用流式细胞术检测对照组、问号钩体感染组和i NOS阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞i NOS蛋白水平。结果表明,问号钩体感染J774A.1细胞后i NOS蛋白表达率由对照组的34.16%上升了8.94、9.77、9.56和9.76倍,问号钩体感染后细胞i NOS蛋白表达量显著上调（P<0.05）,阻断组i NOS蛋白表达率是感染组的0.82、0.64、0.57和0.52倍,阻断后细胞i NOS蛋白表达量显著下调（P<0.05）;问号钩体感染THP-1细胞后i NOS蛋白表达率从对照组的22.08%上升至2.13、2.38、2.35和1.92倍,问号钩体感染后细胞i NOS蛋白表达量显著上调（P<0.05）,阻断组是感染组相同时间段的0.93、0.86、1.11和1.03倍,阻断后细胞i NOS蛋白表达量显著下调（P<0.05）。（3）巨噬细胞NO水平检测:用Griess法检测对照组、问号钩体感染组和i NOS阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞上清中NO含量。结果显示,问号钩体感染J774A.1细胞后NO表达量从对照组的0.1588μmol/L上升了6.75、6.44、6.99和6.51倍,问号钩体感染后细胞NO水平显著升高（P<0.05）;阻断组是感染组的0.50、0.49、0.64和0.73倍,阻断后细胞NO水平显著下降（P<0.05）;THP-1细胞感染后NO表达量由对照组的0.0988μmol/L上升至2.88、3.27、2.80和3.35倍,问号钩体感染后细胞NO水平显著升高（P<0.05）,阻断组是感染组的1.00、0.93、0.94和1.00倍,阻断效果不显著。（4）巨噬细胞内吞噬泡、问号钩体形态、数量与分布观察:用透射电子显微镜观察问号钩体感染组和i NOS阻断剂处理后感染的阻断组4h、12h和24h的J774A.1和THP-1细胞内吞噬泡膜、问号钩体形态、数量与分布情况。观察结果显示,问号钩体在J774A.1细胞内被吞噬泡膜包围,随着感染时间的延长,细胞内问号钩体数量下降,且问号钩体典型形态变得不完整,但在经阻断剂处理后问号钩体在J774A.1细胞内被吞噬泡膜包围的现象明显减少,随着感染时间的延长,细胞内问号钩体数量有所增加,且问号钩体保持完整典型形态。而大多数问号钩体在阻断剂处理前后的THP-1细胞内均游离在细胞浆内,随着感染时间的延长,细胞内问号钩体数量均有增多,问号钩体均保持完整典型形态。（5）巨噬细胞内问号钩体与溶酶体LAMP-1的共定位观察:结合特异性荧光抗体染色,用激光共聚焦显微镜观察问号钩体感染组和i NOS阻断剂处理后感染的阻断组4h、12h和24h的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体与细胞溶酶体LAMP-1的共定位情况。观察结果揭示,J774A.1细胞内问号钩体与LAMP-1的共定位随感染时间的延长而增加,胞内问号钩体特异荧光逐渐变少,但经阻断剂处理剂处理后问号钩体与LAMP-1的共定位随感染时间延长而明显减少。THP-1细胞内问号钩体与溶酶体膜标志LAMP-1共定位随时间的感染时间的延长减少,胞内问号钩体特异荧光逐渐增多,阻断剂对问号钩体与THP-1细胞溶酶体膜LAMP-1的共定位没有明显影响。（6）巨噬细胞内问号钩体活性检测:用流式细胞术检测对照组、问号钩体感染组和i NOS阻断剂处理后感染的阻断组的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体活性。结果显示,问号钩体感染J774A.1细胞后,细胞内问号钩体活性从对数生长期问号钩体的97.03%,,降低到61.45%、42.53%、33.38%和30.23%,感染后胞内钩体活性显著下降（P<0.05）,阻断组是感染组相同时间段的1.18、1.58、1.89和1.77倍,阻断后胞内钩体活性显著上调（P<0.05）。感染组THP-1细胞内问号钩体活性从对数生长期的96.87%,降低到76.98%、66.63%、60.05%和73.66%,感染后胞内钩体活性明显下降（P<0.05）,阻断组为感染组相同时间段的1.01、0.99、1.04和1.01倍,阻断效果不显著。结论:1.问号钩体感染后J774A.1和THP-1细胞NADPH氧化酶活性、ROIS相关的超氧离子水平和ROS水平均有显著上调,但以感染的小鼠巨噬细胞上调更为显著。小鼠巨噬细胞内的问号钩体被吞噬泡膜包围的现象随感染时间的延长而减少,问号钩体形态清晰且数目逐渐增多,胞内问号钩体与溶酶体膜共定逐渐减少,而THP-1细胞内溶酶体与问号钩体的共定位略有减少,问号钩体数目略有增加,提示ROIS途径均参与小鼠和人巨噬细胞对问号钩体的杀菌作用,但在人和小鼠巨噬细胞杀灭钩体作用中具有明显差异。2.问号钩体感染后J774A.1和THP-1细胞i NOS基因m RNA水平、i NOS蛋白水平、RNIS主要的杀菌产物NO等均有显著上调,但以感染的小鼠巨噬细胞上调更为显著。RNIS途径阻断后电镜和激光共聚焦结果显示,小鼠巨噬细胞内的问号钩体被吞噬泡膜包围的现象随感染时间的延长而减少,问号钩体形态清晰且数目逐渐增多,胞内问号钩体与溶酶体膜LAMP-1共定位逐渐减少,而THP-1细胞内溶酶体膜LAMP-1与问号钩体的共定位略有减少,问号钩体数目略有增加,提示RNIS途径参与小鼠和人巨噬细胞对问号钩体的杀菌作用,但在人和小鼠巨噬细胞杀灭钩体作用中具有明显差异。