研究背景：肥胖是脂肪的合成与组织中脂肪的氧化不平衡所致,进而在人体唯一的能量储存库中将多余的能量和脂肪储存起来(在脂肪细胞中以甘油三酯的形式储存),但又缺乏有效的负反馈机制来清除堆积的脂肪。肥胖已成为当今世界重要的健康危害,而且发病率正逐年上升。1982年到2002年的20年间,中国的肥胖及超重的患病率增加了4.1倍,从3.7%增加到了19.0%,并且仍有快速增加的趋势。肥胖患病率增加的主要原因包括饮食结构的改变,生活水平的提高,体力活动的减少及城市化程度的增加。中心型肥胖越来越普遍,两个基于上海人群的横断面研究显示,近20年来,中心型肥胖的患病率已经从19.5%增加到27.3%。肥胖是多种代谢性疾病的危险因素,主要包括2型糖尿病,高血压、冠心病和非酒精性脂肪肝。肥胖相关的代谢性疾病常伴有血脂指标的异常,这些指标的异常常由于较高的血甘油三酯水平及甘油三酯的异位沉积导致。白色脂肪组织主要由白色脂肪细胞构成,它的主要功能是调节能量代谢及以甘油三酯的形式储存能量。它还参与其他生物学过程,如血管生成,控制血压及免疫。白色脂肪组织主要是通过分泌激素及细胞因子调节上述生物学过程。肥胖的发病原因十分复杂,遗传和环境因素均可以影响它的发生、发展和易感性。本课题主要研究激素参与肥胖的发生、发展。亚临床甲状腺功能减退(Subclinical hypothyroidism),简称亚甲减,指血清促甲状腺激素(TSH)水平超过正常值上限而血清游离甲状腺素正常的一组临床综合征。亚临床甲减是临床常见的甲状腺功能异常,成年人中患病率约为4-20%。近年来随着临床检验水平的进步,亚临床甲减的检出率明显上升,人们对亚临床甲减的研究也进一步深入。既往研究显示亚临床甲减能引起心脏功能障碍,精神和认知功能障碍,神经肌肉功能异常。近年来研究表明亚临床甲减与血脂异常、肥胖的发生有关,但患者甲状腺自身抗体、血压以及体重指数这些参数均不能合理解释这种相关性。近年来的研究发现脂肪细胞的细胞膜表面有功能性的促甲状腺激素受体(TSHR)的表达,因此有学者提出TSH可能通过作用于脂肪细胞表面的TSH受体,改变脂肪细胞的生长、分化及调节脂肪细胞的多种分泌功能,从而影响肥胖的发生。TSH的主要作用是刺激甲状腺增殖、碘摄取、甲状腺激素的合成和释放。流行病学研究显示亚临床甲减患者血清TSH水平与肥胖程度呈正相关；即使在甲功正常者TSH水平也与BMI呈正相关；肥胖患者血清TSH水平亦较非肥胖患者高。以上研究均说明TSH与肥胖之间有内在的关联,但TSH影响肥胖的具体分子机制不明。既往研究认为TSH受体仅表达与甲状腺组织。近年来,越来越多的研究发现TSH受体表达在甲状腺外的组织,如脂肪,肝脏等。本实验室前期研究发现TSH能促进3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,干扰掉TSH受体后3T3-L1前脂肪细胞的分化受到抑制。Haraguchi等研究也发现大鼠前脂肪细胞诱导、分化过程中伴随着TSH受体的表达。Valyasevi等在人体眶内前脂肪细胞向脂肪细胞的分化过程中也伴有TSH受体的表达。Lu等在对小鼠胚胎干细胞的研究中发现TSH能刺激脂肪生成。以上研究均显示TSH参与脂肪细胞的分化。肥胖的特征是一种肥大性疾病,包括增加的脂肪细胞数量和增大的脂肪细胞体积两个方面。本实验室之前研究已经证实TSH可以通过促进前脂肪细胞向脂肪细胞的分化来增加脂肪细胞的数量。脂肪细胞的数量多少主要是在儿童及青春期决定。脂肪细胞的肥大(即脂肪细胞体积增加)的主因是甘油三酯合成增加,并且是成年人肥胖的主要原因。Beook等研究显示所有肥胖的人均有脂肪细胞的体积增大,但是脂肪细胞的数量增加仅见于肥胖的儿童及儿童时期即肥胖的成人。因此,脂肪细胞体积(即细胞内甘油三酯含量)是成年人肥胖与否的决定因素。然而,TSH调节成熟脂肪细胞甘油三酯合成的作用还有待进一步研究。甘油磷酸酰基转移酶(GPAT)是人体内甘油三酯合成的限速酶。GPAT3是脂肪细胞中GPAT最重要的亚型,在脂肪细胞甘油三酯合成中起最重要的作用。在哺乳动物细胞中过表达GPAT3能促进甘油三酯合成,而在3T3-L1脂肪细胞中敲除GPAT3能抑制甘油三酯合成。目前研究显示GPAT3的表达及活性主要受胰岛素,乙醇,糖皮质激素受体及噻唑烷二酮类药物的调节。然而,TSH是否通过调节成熟脂肪细胞的GPAT3表达影响甘油三酯合成尚有待研究。目前,TSH对肥胖作用的具体集中研究的研究仍较少见,TSH如何调节成熟脂肪细胞甘油三酯合成并进一步引起肥胖的分子机制仍有待进一步研究。本项目将进一步探讨在TSH对脂肪细胞甘油三酯合成的作用,并在小鼠体内研究其在肥胖发生中所起的作用。并采用细胞及分子生物学的方法,建立成熟脂肪细胞的模型,研究其信号通路及分子机制,从而进一步揭示TSH与GPAT3表达之间的关系。目前,通过调整激素水平抑制食欲、增加能量消耗以控制体重的增加已经成为目前肥胖治疗研究热点之一。本研究从新的角度探讨了激素对肥胖形成机制的认识,并可能为亚临床甲状腺功能减退合并肥胖的治疗开拓思路及提供理论依据。目的：1、确定促甲状腺激素调节脂肪组织甘油三酯含量,利用亚临床甲状腺功能减退的小鼠模型及TSH刺激的成熟3T3-L1脂肪细胞研究TSH对脂肪细胞甘油三酯合成的作用。2、通过TSH受体敲除的小鼠体内脂质代谢相关酶的mRNA变化,筛选出TSH可能的作用靶点。3、通过TSH刺激成熟3T3-L1脂肪细胞,检钡GPAT3、PPAR γ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平,探讨TSH引起脂质合成增加的可能机制。4、通过TSH受体敲除的小鼠模型,检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平,进一步探讨TSH引起脂质合成增加的可能机制。5、利用PPAR γ、AMPK特异性阻断剂或TSHR、PPARγ、GPAT3特异性小干扰RNA (Small Interfering RNA, siRNA)或转染持续激活或抑制性AMPK质粒处理细胞,检钡GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的表达,探讨TSHR、AMPK、 PPARγ、GPAT3在TSH所引起的脂质沉积中所起的作用。研究方法：1、细胞培养：1)3T3-L1细胞根据美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞培养标准使用高糖DMEM培养液中培养、诱导分化。2)人脂肪原代细胞、小鼠脂肪原代细胞人或小鼠脂肪组织剪碎,使用Ⅰ型胶原酶在37℃孵箱中消化30-40 min,过筛去掉未消化的组织,PBS冲洗细胞,并接种在新的培养皿中,使用含新生牛血清的DMEM/F12培养基培养。2、动物模型：通过小剂量他巴唑喂养建立亚临床甲状腺功能减退小鼠模型,并在Jackson实验室购买TSHR敲除小鼠模型。3、采用RT-PCR检测GPAT3、PPARγ mRNA的表达。4、采用Western Blotting检测GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK及beta-actin蛋白水平变化。5、采用免疫荧光方法检测GPAT3、PPARγ在脂肪组织及细胞中的表达,H&E染色了解组织结构。6.GPAT3、PPARγ及TSHR基因沉默：以GPAT3、PPARγ及TSHR特异性siRNA转染成熟3T3-L1脂肪细胞以沉默GPAT3、PPARγ及TSHR表达。7、AMPK持续激活或抑制：以CA-AMPK或DN-AMPK质粒转染成熟3T3-L1脂肪细胞以持续激活或抑制AMPK表达。8、GPAT3、PPARγ活性检测：采用荧光素酶报告基因的方法检测GPAT3、 PPARγ的活性。9、采用酶联免疫分析检测小鼠体内adiponectin的水平变化。结果：1、促甲状腺激素调节脂肪组织甘油三酯含量：亚临床甲状腺功能减退的小鼠表现为体重增加,总脂肪重量增加,有较高的BMI水平及附睾脂肪指数。进一步处死小鼠后分别观察了两组小鼠的附睾、肾周白色脂肪组织的外观及脂肪细胞的体积大小(H&E染色),发现亚临床甲状腺功能减退的小鼠附睾、肾周白色脂肪组织含量较对照组小鼠显著增加,脂肪细胞体积增大。通过体外实验证实,促甲状腺激素刺激显著增加成熟的3T3-L1脂肪细胞内的脂滴数量。与之一致的,3T3-L1脂肪细胞内的甘油三酯含量在TSH的刺激下呈时间、剂量依赖性的增加。2、TSH调节甘油三酯合成是通过GPAT3:体内实验发现,TSHR敲除的小鼠体内GPAT3 mRNA及蛋白表达均显著下降。体外研究发现TSH能刺激GPAT3的蛋白表达及其在胞浆的聚集并增加GPAT3的活性。利用GPAT3 siRNA干扰掉GPAT3后,TSH介导的甘油三酯合成被阻断。3.PPARγ在促甲状腺激素介导的脂质生成中是必不可少的：体内研究发现,TSHR敲除的小鼠PPARγ mRNA水平较对照组小鼠水平下降。Western blotting检测发现TSHR敲除的小鼠PPARγ蛋白较对照组小鼠表达水平下降。体外研究显示,在成熟的3T3-L1脂肪细胞中,利用免疫荧光的方法检钡PPARγ的蛋白表达,发现TSH刺激的细胞PPARγ蛋白在细胞核内的聚集明显。Western blotting检测发现,TSH刺激的成熟的3T3-L1脂肪细胞、人原代脂肪细胞及小鼠原代脂肪细胞中PPAγ核蛋白表达显著增加。实时定量PCR显示促甲状腺激素刺激的成熟的3T3-L1脂肪细胞PPARγ mRNA表达显著增加。利用PPARγ siRNA干扰掉PPARγ后,TSH介导的甘油三酯合成及激活GPAT3的作用被阻断。4、AMPK介导TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成：体内实验证实,AICAR喂养的TSHR受体敲除的小鼠脂肪组织PPARγ、GPAT3的蛋白、mRNA表达均下降。体外研究显示,转染CA-AMPK抑制TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成；转染DN-AMPK激活TSH引起的PPARγ/GPAT3上调及脂质合成。5、TSHR参与TSH介导的脂质生成：体内实验证实,TSHR敲除的小鼠表现为体重下降,附睾脂肪重量降低,有较低的附睾脂肪指数。进一步处死小鼠后分别观察了两组小鼠的附睾、肾周白色脂肪组织的外观及脂肪细胞的体积大小(H&E染色),发现TSHR敲除的小鼠附睾、肾周白色脂肪组织含量较野生型小鼠显著降低,脂肪细胞体积下降。Western显示TSHR敲除的小鼠GPAT3表达下降。通过体外实验证实,利用TSHR siRNA干扰掉TSHR后,TSH介导的甘油三酯合成及激活AMPK/PPARγ/GPAT3的作用被阻断。结论：在成熟脂肪细胞中,TSH通过结合到TSH受体,阻断AMPK Thr172位点的磷酸化,激活PPARγ转录激活系统,进而增加GPAT3的表达,促进肥胖的发生和发展。