研究背景:甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤之一,近年来其发病率在世界范围内不断增加。绝大部分甲状腺癌起源于甲状腺的滤泡上皮细胞。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）作为分化程度最高的甲状腺癌也是最常见的甲状腺癌病理类型,约占甲状腺癌总数的80%-90%。大多数PTC具有良好的预后,20年生存率可以达到95%,因为其常表现出较低的恶性程度。然而,部分具有侵袭性的PTC的复发、转移以及对放射性碘疗法的抵抗仍然是PTC患者死亡的主要原因,有超过25%的PTC患者在较长的随访期间出现复发,且有资料显示PTC患者颈淋巴结转移是PTC复发的高危因素,直接影响了PTC患者的生存。目前,人们并没有完全了解PTC的发病机制,进一步深入研究调控其恶性生物学行为的分子机制,可以为寻找早期诊断的生物标志物及治疗的新靶点提供新的方向,也为进一步提高整体治疗水平,改善PTC患者的生活质量做出积极的尝试。Suprabasin（SBSN）最早发现于小鼠表皮的基底上层中,且被认为在表皮分化过程中扮演着重要角色。最近的研究发现,SBSN的异常调控与包括癌症以及免疫性疾病在内的多种疾病的发生发展有关。SBSN可以通过调控细胞信号通路从而影响肿瘤细胞的恶性生物学行为及免疫抵抗等过程。但是SBSN在PTC发生发展中的生物学功能及预后价值尚不清楚。本课题对SBSN调控PTC恶性生物学行为的作用和相关分子调控机制,以及与肿瘤免疫浸润的相关性进行了探讨。研究方法:1、收集80例甲状腺乳头状癌患者的癌组织和匹配的癌旁正常甲状腺组织（距离肿瘤边缘2cm以上,经病理诊断为正常甲状腺组织）。采用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）、蛋白印迹（Western blot）以及免疫组化实验（SP法）检测PTC组织和配对癌旁正常组织中SBSN基因mRNA及蛋白的表达水平。通过统计q RT-PCR、Western Blot及免疫组化实验的结果分析SBSN异常表达与PTC患者临床病理特征之间的关系。2、培养甲状腺滤泡上皮细胞系（Nthy-ori-3-1）及甲状腺乳头状癌细胞系（K1,TPC-1）,Western blot检测细胞内SBSN的表达情况。3、通过转染si RNA在PTC细胞内敲减SBSN的表达,q RT-PCR及Western blot检测SBSN表达的敲减情况,评估转染效率及确定最佳转染浓度。通过MTS法检测在PTC细胞内敲减SBSN基因表达对细胞增殖能力的影响;划痕实验检测了敲减SBSN基因表达对PTC细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测了敲减SBSN基因表达对PTC细胞侵袭能力的影响;碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）法检测敲减SBSN基因表达对PTC细胞周期的影响;PI/FITC法检测在PTC中敲减SBSN基因表达对细胞凋亡的影响。4、Western blot检测敲减SBSN基因表达后抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax、增殖细胞核抗原PCNA、细胞周期蛋白Cyclin D1以及上皮间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。5、基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索SBSN可能参与的信号通路,分别设置小干扰组、阴性对照组及空白对照组并检测各组信号分子p-p38MAPK、p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β、AKT及p-AKT等蛋白表达水平的变化,评估增殖转移相关的p38MAPK及AKT等信号通路激活情况;利用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据集对PTC中SBSN的表达进行了全面的生物信息学分析,并通过免疫组化染色验证了SBSN的表达与PTC组织中M2巨噬细胞和调节性T细胞（T regulatory cells,Tregs）密度的关系。结果:1、q RT-PCR及Western blot结果表明癌组织中SBSN mRNA及蛋白的相对表达量分别为8.228±1.452和2.218±0.343,明显高于癌旁正常组织（5.037±0.783和1.563±0.279）（P＜0.05）;免疫组化染色结果显示,癌组织中SBSN阳性表达率为85%（68/80）,癌旁正常组织SBSN的阳性表达率为23.75%（19/80）,明显低于癌组织（P＜0.05）;SBSN的高表达与PTC患者的淋巴结转移密切相关（P＜0.05）,而与患者性别、肿瘤大小、包膜侵犯、年龄及肿瘤多灶性无明显相关性。2、PTC细胞系K1,TPC-1中SBSN的表达水平明显高于其在甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori-3-1中的表达（P＜0.05）。3、研究敲减SBSN表达后对PTC细胞系恶性生物学行为的影响。MTS实验结果显示,SBSN表达敲减后细胞增殖能力显著弱于对照组。流式细胞仪检测结果显示,SBSN敲减组的凋亡率明显高于对照组,SBSN表达敲减后阻滞了细胞分裂相从G0/G1期向S期的转变。Transwell实验表明SBSN表达敲减后可显著降低细胞侵袭能力。划痕实验显示SBSN敲减组的伤口愈合速度明显低于对照组,敲减SBSN表达抑制了细胞迁移能力（P＜0.05）。4、应用Western blot检测SBSN基因表达敲减后细胞周期蛋白Cyclin D1、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2、增殖细胞核抗原PCNA、及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达情况。结果显示,SBSN基因表达敲减后两种PTC细胞系的PCNA、Cyclin D1及Bcl-2的表达降低,而Bax的表达增加（P＜0.05）。当SBSN敲减后,N-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin表达下调,E-cadherin表达增加（P＜0.05）。5、富集分析结果显示SBSN及其共表达蛋白在MAPK及PI3K/AKT通路中富集,我们应用Western blot检测了PTC细胞未转染组,阴性对照组及敲减组中p38MAPK、p-p38MAPK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达,观察到敲减SBSN基因表达后两种PTC细胞系的p-p38MAPK及p-AKT蛋白相对表达水平均明显减少（P＜0.05）,而p-ERK1/2及p-GSK-3β蛋白表达无明显变化。在敲减SBSN后两种PTC细胞系未转染组,阴性对照组及敲减组中p38MAPK、AKT、ERK1/2及GSK-3β的蛋白表达水平均无明显差异。6、对肿瘤微环境的分析（使用CIBERSORT-ABS和x Cell算法）显示,SBSN的表达影响了PTC中免疫细胞的浸润和癌症免疫循环。免疫组化证实,在PTC组织中,SBSN阳性表达组的CD163+M2巨噬细胞（10.30±4.256）和Foxp3+Tregs（7.697±3.115）的浸润水平高于SBSN阴性表达组（5.35±2.652,4.583±2.276）（P＜0.05）。结论:1、PTC组织中SBSN mRNA和蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织,且SBSN的异常表达与PTC淋巴结转移密切相关。2、SBSN基因可以增强PTC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,敲减SBSN表达后这些能力则受到抑制,同时敲减SBSN表达会诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。3、敲减SBSN表达抑制PTC细胞PCNA、Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin的表达,促进E-cadherin及Bax的表达。4、SBSN基因可能通过调节p38MAPK及PI3K/AKT通路从而参与调节PTC细胞恶性生物学行为。5、SBSN可以调节PTC中免疫细胞的浸润从而影响肿瘤的免疫抑制,这表明SBSN可能是一个治疗靶点,可以通过靶向SBSN增强抗肿瘤免疫反应。