类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是最常见的全身性自身免疫性疾病其主要病理特征是关节炎症、血管翳形成、滑膜增生以及软骨和骨组织损伤。RA患者不仅有关节损伤,而且还有其他器官损伤例如肾脏和心血管损伤。心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)是RA早逝和猝死的主要原因。RA是独立的心血管危险因素,其全身性炎症是最终导致心血管事件的重要因素。内皮功能障碍导致的血管炎在CVD中起重要作用,并且是CVD事件的先兆。RA患者的大血管和微血管中均存在内皮功能障碍。内皮功能障碍主要表现为内皮细胞活化。活化的内皮细胞表达粘附分子如细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),并具有促凝血和促粘附特性。内皮细胞是各种促炎细胞因子和抗炎细胞因子的主要靶标之一。内皮细胞活化通常由促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和IL-17诱导,并促进循环白细胞的募集和粘附。目前许多研究集中在IL-17对内皮细胞激活的影响。IL-17主要由T辅助17(T helper 17,TH17)细胞产生,主要效应分子为IL-17A。IL-17A参与内皮细胞的活化,导致内皮功能障碍。转录信号转导激活子3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3)是STAT蛋白家族的成员,是炎症过程中重要的潜在调节剂。TH17细胞的分化和调节与STAT3信号有关,更重要的是STAT3在内皮细胞活化中也起到关键作用,能够增加内皮细胞中ICAM-1的表达。因此,了解TH17或IL-17A与JAKs/STAT3信号通路在内皮细胞活化调控中的潜在关系将有助于充分阐明RA炎性微环境中内皮细胞激活的分子机制。有研究表明芍药苷具有血管保护作用,但是其发挥血管保护作用的机制并不清楚。芍药苷-6’-邻苯磺酸酯(Paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)是本实验室对芍药苷进行结构修饰得到的活性单体,前期研究表明CP-25与芍药苷发挥类似的抗炎作用,且口服吸收比芍药苷好。CP-25具有免疫调节功能,能够抑制淋巴细胞增殖,减缓炎症进展。CP-25通过BAFF-TRAF2-NF-κB信号通路调节B细胞的功能。CP-25对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠血管炎的影响目前尚不清楚。根据以上背景,本实验提出以下科学问题,JAKs/STAT3信号通路是否参与CIA大鼠T细胞的分化以及内皮细胞的活化?CP-25是否能够改善CIA大鼠血管炎?CP-25是否通过JAKs/STAT3信号通路抑制T细胞功能以及内皮细胞活化改善血管炎?本课题选择高脂饮食(high fat diet,HFD)CIA大鼠为实验模型动物,观察CP-25对HFD CIA大鼠血管炎的治疗作用以及对T细胞亚群活化和分化的影响。体外选择大鼠脾脏细胞进行研究,阐明CP-25调节JAKs/STAT3信号通路抑制T细胞功能的分子机制。体外选择人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作为模型细胞,阐明CP-25调节JAKs/STAT3信号通路抑制内皮细胞活化的分子机制。目的:研究HFD CIA大鼠血管炎的发生机制以及CP-25对HFD CIA大鼠血管炎的治疗作用。阐明CP-25调控JAKs/STAT3信号通路抑制T细胞功能以及内皮细胞活化改善HFD CIA大鼠血管炎的分子机制。方法:1.SD雄性大鼠随机分为六组:正常组(Normal group)、高脂饮食组(HFD group)、CIA组(CIA group)、高脂饮食CIA组(HFD CIA group)、CP-25组(50mg/kg)(CP-25 group)、MTX组(0.5mg/kg)(MTX group)。大鼠成模后按体重计算给药剂量,CP-25组每天给药一次,MTX每周给药两次,均采用灌胃给药。给药维持40天。每周评价各组大鼠的整体指标:全身评分(global scoring)、关节炎指数(arthritis index,AI)、关节肿胀数(swollen joint count,SJC);计算各组大鼠胸腺和脾脏指数;CCK-8法检测各组大鼠脾脏B细胞和胸腺T细胞的增殖能力;对脾脏、踝关节和主动脉进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色,观察病理学变化并评分。2. 流式细胞术检测不同炎症时期大鼠的外周血和脾脏T细胞亚群的百分比:CD3~+T细胞、CD3~+CD4~+T细胞、CD3~+CD4~+CD25~+T细胞、TH1细胞(CD4~+INF-γ~+)、TH2细胞(CD4~+IL-4~+)、TH17细胞(CD4~+IL-17~+)。3. 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清中IL-17A和ICAM-1的水平,生化试剂盒检测大鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的水平。4.免疫荧光法检测大鼠血管p-STAT3的表达。5.体外使用细胞刺激剂刺激大鼠脾脏单细胞悬液,然后加入CP-25孵育24h,收集细胞,WB法检测JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3、p-STAT3、RORγ-T和IL-17A蛋白的表达。6.体外使用不同浓度IL-17A刺激HUVECs,收集细胞,WB法检测JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3和p-STAT3蛋白的表达,收集培养上清,ELISA法检测ICAM-1的水平。7.体外使用IL-17A(50ng/m L)刺激HUVECs,然后用CP-25干预,收集细胞,WB法检测JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3和-STAT3蛋白的表达,收集培养上清,ELISA法检测ICAM-1的水平。结果:1.CP-25对HFD CIA大鼠继发炎症和血管炎有治疗作用对大鼠进行整体指标评分,计算脾脏指数和胸腺指数,检测T,B细胞增殖能力,用H&E染色法检测大鼠组织病理变化。结果表明与CIA组相比,HFD CIA大鼠全身炎症反应出现较晚,但是更严重,且炎症消退缓慢。CP-25能够降低HFD CIA大鼠整体指标评分,降低脾脏、胸腺指数以及T/B细胞增殖能力。H&E染色结果显示,与CIA组相比,HFD CIA大鼠脾脏、踝关节和主动脉病变更严重,HFD CIA大鼠主动脉内皮排列紊乱且出现局部增厚。CP-25能够明显改善HFD CIA大鼠脾脏、踝关节和主动脉病变。2.CP-25能够抑制HFD CIA大鼠T细胞功能流式结果显示,与CIA组相比,HFD CIA大鼠体内T细胞亚群在炎症早期升高较缓慢,但炎症高峰期T细胞亚群显著升高,且直至试验周期结束未见明显降低。CP-25能够缓慢抑制HFD CIA大鼠T细胞亚群的比例,且对TH17细胞有一定的选择性。3. CP-25能够抑制HFD CIA大鼠血清IL-17A以及ICAM-1水平,对血脂水平无影响血清ELISA结果显示,HFD CIA组血清IL-17A和ICAM-1水平升高最显著,CP-25能够明显降低HFD CIA大鼠血清IL-17A和ICAM-1的水平。高脂饮食的大鼠血清TC、TG、LDL的水平均升高,血清HDL水平无明显变化,CP-25对血清TC、TG、LDL、HDL的水平均没有影响。4. CP-25抑制大鼠主动脉p-STAT3的表达免疫荧光结果显示,HFD CIA组大鼠主动脉p-STAT3表达升高最明显,CP-25降低主动脉p-STAT3表达至接近正常水平。5. CP-25抑制JAKs/STAT3信号通路抑制T细胞向TH17细胞分化体外使用细胞刺激剂刺激T细胞向TH17细胞分化,然后加入CP-25干预。结果显示,CP-25能够明显降低T细胞中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3和p-STAT3以及RORγ-T和IL-17A的表达。6. IL-17A激活JAKs/STAT3信号通路促进内皮细胞活化体外使用IL-17A刺激HUVECs。结果显示IL-17A(50ng/m L)能够明显刺激HUVECs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3和p-STAT3的表达以及ICAM-1的分泌。7. CP-25抑制JAKs/STAT3信号通路抑制内皮细胞活化体外使用IL-17A刺激HUVECs,然后加CP-25干预。结果显示CP-25能够明显抑制HUVECs中p-JAK1、p-JAK2、p-JAK3和p-STAT3的表达以及ICAM-1的分泌。结论:1.JAKs/STAT3信号通路在HFD CIA大鼠中过度活化,进而促进T细胞功能和内皮细胞活化。2.CP-25能够抑制HFD CIA大鼠的继发炎症和血管炎。3.CP-25通过抑制T细胞功能和内皮细胞活化发挥抗炎作用。4.CP-25可能通过调节JAKs/STAT3信号通路抑制T细胞向TH17分化和内皮细胞活化,进而抑制血管炎。